알츠하이머병 모델을 위한 아밀로이드-베타 단백질의 직접 입체성 뇌 주입

초록

출처: Jean, Y. Y. et al., 마우스 해마에 올리고머 아밀로이드-베타의 입체성 주입. J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 알츠하이머병의 마우스 모델을 확립하기 위해 아밀로이드 베타를 치상회에 정확하게 입체적으로 주입하는 방법을 보여줍니다. 정확한 좌표 결정과 아밀로이드 베타 단백질의 제어된 전달은 신경 세포 분해를 초래하여 기억 처리를 방해하고 알츠하이머병 발병에 기여합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수술을 위한 수술 기구 및 용액 준비

1. 모든 스테인리스 스틸 수술 기구를 오토클레이브합니다.
2. 200 proof absolute ethanol을 멸균 분자 등급의 탈이온화 증류수로 희석하여 70% 에탄올을 준비합니다.
3. 29G 바늘을 Hamilton 주사기에 부착합니다. 해밀턴 주사기와 바늘의 내부를 1분 동안 나노 순수를 끌어 올리고 배출하기를 반복하여 청소합니다. 70% 에탄올로 이 절차를 반복합니다.
   1. Hamilton 주사기에서 플런저와 바늘을 제거합니다. 층류 후드 O/N에서 부품을 자연 건조합니다.
   2. 사용하기 전에 바늘과 주사기에 자외선을 30분 동안 조사하십시오.
4. 염화나트륨(NaCl)을 분자 등급의 물에 용해시켜 식염수를 0.9%의 최종 중량 대 부피 농도로 준비합니다. 0.2μm 공극 필터를 통해 용액을 여과하여 멸균합니다.

2. 올리고머 아밀로이드-베타(Aβ1-42) 준비

1. Dimethylsulfoxide(DMSO)의 재조합 인간 Aβ1-42를 Fa' 및 기타 논문의 간행물에 기술된 대로 정확히 5mM로 단량체화 및 재현탁합니다.
2. 수술 전날 5mM Aβ1-42를 멸균(1x) 인산염 완충 식염수(PBS)와 함께 100μM로 희석합니다.
3. 트리추레이션으로 용액을 잘 혼합하십시오.
4. Aβ1-42 용액을 4°C.
   에서 12시간 동안 배양합니다. 메모: PBS에서 DMSO를 희석하거나 스크램블/리버스 Aβ1-42 펩타이드와 같은 대조 용액은 Aβ1-42와 동일한 방식으로 준비해야 합니다.

3. 주입 좌표 결정

1. 성체 마우스 뇌 지도를 사용하여 관심 뇌 영역에 대한 정확한 전방-후방(AP), 내측(ML) 및 배측-복부(DV) 좌표를 결정합니다.
   메모: 이 기술을 설명하기 위해 우리는 브레그마에서 다음 좌표를 가진 표적으로 해마의 치상회(dentate gyrus)를 선택했습니다: AP, -2.00 mm; ML, ±1.3mm; DV, -2.2mm. AP 값 앞의 음수 기호는 브레그마의 2.00mm 후방임을 나타냅니다. ML 값 앞의 ± 기호는 중앙에서 왼쪽과 오른쪽 방향을 나타냅니다. 마지막으로, DV 앞의 음수 기호는 DV가 뇌 표면에서 복부 방향으로 움직이고 있음을 나타냅니다.

4. 스테레오택시 프레임 설정

1. 수술용 안면 마스크, 깨끗한 실험복, 멸균 수술용 장갑을 착용하십시오.
2. 입체식 기기와 마우스 어댑터를 70% 에탄올로 닦습니다.
3. 카운터에 멸균 수술용 드레이프를 깔아주세요.
4. 멸균 수술용 드레이프 위에 마우스 어댑터가 있는 입체성 기구를 놓습니다.
5. 마우스 가열 패드를 70% 에탄올로 닦습니다. 발열 패드를 입체 프레임 베드 위에 놓습니다. 범용 실험실 라벨 테이프를 사용하여 마우스 어댑터 침대 위에 가열 패드를 테이프로 붙입니다.
   1. 제조사의 지시에 따라 온수 재순환 펌프에 가열 패드를 부착하십시오.
   2. 온수 재순환 펌프를 켜고 온도를 37°C로 설정한 다음 해당 온도에 도달할 때까지 기다립니다.
6. 50μl Hamilton 주사기와 29G 바늘을 제조업체의 지시에 따라 전동 수직 주입 샤프트에 나사로 고정하여 입체 주
사기에 부착합니다.
7. 비드 살균기를 켜고 제조업체에서 미리 설정한 온도에 도달할 때까지 기다립니다.
   메모: 이것은 동물 사이의 스테인레스 스틸 기구를 살균하는 데 사용됩니다. 살균을 위해 기구가 비드와 접촉하는 데 20초가 걸립니다.
8. 핫 플레이트를 켜고 42°C로 설정한 다음 그 위에 깨끗한 빈 케이지를 놓습니다.
9. Hamilton 주사기가 입체택시 프레임에 고정되어 있는 동안 전동 입체택시 인젝터를 사용하여 Aβ1-42 용액을 추출합니다.
   메모: 용액을 4μl 이상 주사기에 주입한 다음 입체 주입기를 사용하여 주입량을 설정합니다. 제조업체의 지침에 따라 인젝터를 작동하십시오.

5. 동물 준비

1. 체중계를 사용하여 마우스의 무게를 측정합니다.
2. 100mg/kg 케타민과 10mg/kg 자일라진에서 케타민/자일라진 칵테일을 복강내(IP)로 주사하여 마우스를 마취합니다. 발가락 핀치 반사의 손실로 마취의 깊이를 모니터링합니다.
3. 쥐에게 진정제를 투여한 후 이발기를 가져다가 머리를 면도하여 두개골 위의 피부를 드러냅니다.
4. 입체 침대 위의 가열 패드 위에 마우스를 놓습니다.
5. 주걱을 사용하여 입을 벌리고 앞니를 치아 보호대 안에 넣습니다. 마우스의 앞면에 노즈피스를 고정합니다. 너무 조이지 말고 부드럽게 조입니다.
6. 머리를 고정하기 위해 양측 귀 크로스바를 청각 고기에 배치합니다. 크로스바가 두개골에 닿을 때까지 각 크로스바를 움직인 다음 나사를 돌려 잠급니다.
   1. 머리가 고정되었는지 확인하려면 검지 손가락을 사용하여 머리를 부드럽게 누릅니다. 머리가 제대로 고정되어 있으면 눌러도 머리가 나오거나 움직이지 않습니다.
7. 아이크림 한 방울이나 점안액을 눈에 바르면 눈이 촉촉하게 유지될 수 있습니다. 수술 내내 눈이 촉촉한지 확인하십시오.
8. 수술 부위를 소독하려면 멸균 면봉을 사용하여 베타딘 용액을 두개골 위의 피부에 바른 다음 70% 에탄올을 바릅니다. 베타딘과 70% 에탄올을 번갈아 가며 세척을 2회 더 수행합니다.

6. 수술 및 주입

1. 메스를 사용하여 두피 정중선을 2-3mm 절개 한 다음 곧은 가느다란 가위를 사용하여 절개 선을 1.0-1.5cm까지 연장하여 두개골의 시상 봉합사, 브레그마 및 람다, 입체 좌표의 기반이되는 랜드 마크를 노출시킵니다. 마이크로 클램프를 사용하여 피부를 분리하십시오.
   메모: 브레그마와 람다 위치는 마우스 뇌 아틀라스 "The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates"에 설명되어 있습니다.
2. 면봉을 가져다가 멸균 식염수에 담그고 두개골을 청소하는 데 사용합니다. 그런 다음 깨끗하고 마른 면봉을 사용하여 두개골을 말리십시오.
3. 멸균된 가는 펜을 사용하여 브레그마에 점을 표시합니다. 입체택시 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 바늘 끝이 브레그마의 점에 닿도록 Hamilton 주사기를 배치합니다.
   1. DV 좌표를 기록합니다.
   2. 두개골의 AP 축이 수평인지 확인하려면 바늘 끝이 람다 점에 닿도록 해밀턴 주사기를 후방으로 움직입니다.
   3. DV 위치를 기록합니다. 브레그마 및 람다의 DV 좌표가 0.5mm.
      이내인지 확인합니다. 메모: 목표는 브레그마와 람다 간의 DV 차이를 최소화하는 것입니다.
4. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 Hamilton 주사기 바늘 끝을 브레그마 도트로 되돌립니다.
5. 시작 AP 위치를 기록합니다.
6. 시작 AP 좌표에서 2.00mm를 빼서 끝 AP 위치를 계산합니다.
7. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 Hamilton 주사기 바늘을 최종 AP 좌표로 재배치합니다.
8. 현재 ML 좌표를 기록합니다.
9. 시작 ML 좌표에서 1.3mm를 더하거나 빼서 왼쪽 및 오른쪽 끝 ML 좌표를 계산합니다.
10. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 Hamilton 주사기 바늘을 끝 ML 좌표 중 하나로 이동합니다.
    1. 바늘 끝을 양쪽 끝 ML 좌표의 두개골 표면에 터치하고 DV 좌표를 기록하고 값이 0.5mm.
       이내인지 확인합니다. 참고: 목표는 두 끝 ML 좌표 간의 DV 차이를 최소화하는 것입니다.
    2. 끝 좌표에서 바늘을 두개골 위로 0.5-1cm 위로 당깁니다. 멸균된 가는 펜을 사용하여 두개골 표면에 점을 표시합니다. 두개골의 반대쪽 쪽에 대해 이 단계를 반복합니다.
11. 해밀턴 주사기를 휘둘러 치
우세요.
12. 드릴에 0.8mm 드릴 헤드를 부착합니다. 양손으로 드릴을 잡고 안정성을 위해 테이블 표면에 엘보우를 놓고 드릴 헤드를 왼쪽 또는 오른쪽 ML 좌표의 샤피 점보다 약간 위에 놓습니다. 드릴을 활성화하고 드릴 끝을 두개골 표면으로 내려 두개골에 구멍을 뚫습니다. 반대쪽 쪽에 대해 이 단계를 반복합니다.
    메모: 새로 도입된 구멍에서 약간의 출혈이 발생할 수 있습니다. 출혈이 있는 경우 깨끗하고 마른 면봉을 사용하여 혈액을 두드려 닦습니다.
13. Hamilton 주사기를 새로 도입된 ML 구멍 중 하나의 위치로 다시 이동합니다. 해밀턴 바늘을 두개골 바로 너머로 내립니다. 이 시점에서 뇌에 구멍을 뚫지 않도록 주의하십시오. 바늘이 두개골을 통과했는지 확인하려면 검지 손가락을 잡고 바늘을 두개골에 부드럽게 밀어 바늘이 구멍에서 나오지 않도록 합니다.
14. 시작 DV 좌표를 기록합니다.
15. 시작 DV 좌표에서 2.2mm를 빼서 끝 DV 좌표를 계산합니다.
16. 바늘을 끝 DV 좌표까지 내립니다.
17. 입체택시 주입기 펌프를 활성화하여 4μl의 Aβ1-42를 0.5μl/분의 속도로 치상회(dentate gyrus)로 펌핑합니다.
18. 주입이 완료되면 주사 부위에서 용액이 역류하는 것을 최소화하기 위해 바늘을 추가로 1분 동안 제자리에 두십시오.
19. 바늘을 뇌의 다른 쪽으로 옮기고 6.13-6.18단계를 반복합니다.

7. 동물 제거 및 수술 후 관리

1. 이어바와 얼굴/코 보호대의 나사를 풉니다. 기기에서 마우스를 제거합니다.
2. 학생 표준 패턴 집게를 사용하여 두피를 당겨 닫은 다음 봉합사로 상처를 봉합합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
케타민 HCl (100mg/ml)	헨리 샤인 메디컬	1049007	동물 1kg당 케타민 100mg
자일라진 (20mg/ml)	헨리 샤인 메디컬	사용할 수 없음	동물 1kg당 자일라진 10mg
Aβ1-42	데이비드 테플로(David Teplow)/UCLA	사용할 수 없음	100 μM; 이 아밀로이드는 논문에 사용되었습니다
Aβ1-42	바헴	H-1368	Teplow 실험실의 아밀로이드 대신 사용할 수 있습니다
Aβ1-42	미국 펩타이드	62-0-80B	Teplow 실험실의 아밀로이드 대신 사용할 수 있습니다
스크램블 Aβ1-42	미국 펩타이드	62-0-46B	Aβ1-42 비교를 위한 대조 펩티드로 사용될 수 있습니다
GenTeal 윤활유 아이 젤	노바티스	사용할 수 없음	수술 중 마우스 눈을 촉촉하게 유지하기 위해; 지역 약국에서 찾을 수 있습니다
리프레시 옵티브 루브리컨트 아이 드롭	엘러간	사용할 수 없음	수술 중 마우스 눈을 촉촉하게 유지하기 위해; 지역 약국에서 찾을 수 있습니다. GenTeal 대신 사용할 수 있습니다.
베타딘	스톨팅	50998	제균 및 소독을 위해
라운드/테이퍼드 스패츌라	폭스바겐	82027-490	동물의 입을 열기 위해
Bulldog Serrefines 클램프 (턱 치수. 9X1.6mm; 길이 28mm)	정밀 과학 도구	18050-28	선택적; 주사 중 두피 피부를 분리하는 데 사용됩니다.
스트레이트 파인 가위 (절삭 날 25mm; 길이 11.5 cm)	정밀 과학 도구	14060-11	두피 절단용
#3 메스 손잡이	정밀 과학 도구	10003-12
#11 수술용 블레이드	정밀 과학 도구	10011-00	두피 절개용
학생 표준 패턴 집게(팁 치수. 2.5x1.5mm; 길이 11.5 cm)	정밀 과학 도구	91100-12	봉합하는 동안 두피를 닫은 상태로 유지하기 위해
트리머 콤보 키트	켄트 사이언티픽	CL9990-1201	수염 면도용
T/펌프 온수 재순환기	켄트 사이언티픽	티피-700	수술 중 동물을 따뜻하게 하기 위해
재사용 가능한 워마이닝 패드(5" x 10")	켄트 사이언티픽	TPZ-0510FEA	T/Pump 온수 순환기에 부착하여 수술 중 동물을 따뜻하게 하기 위해
무선 마이크로 드릴	스톨팅	58610	0.8mm 강철 버를 사용하여 두개골에 구멍을 뚫습니다.
마우스 & 신생아 쥐 어댑터가 있는 Lab Standard 스테레오택시 기기	스톨팅	51615
Just for Mouse 입체 악기	스톨팅	51730	Stoelting Cat 대신 사용할 수 있습니다. #51615
Quintessential 입체택시 인젝터	스톨팅	53311
드라이 유리 비드 살균기	스톨팅	50287	스테인레스 스틸 기구 살균용
멸균 수술용 드레이프(18" x 26")	스톨팅	50981
해밀턴 시린지 50 ml, 모델 705 RN SYR, NDL	해밀턴 컴퍼니	7637-01	뇌 주사를 위해; 다른 해결책을위한 다른 주사기를 사용하십시오
29 게이지 바늘, 소형 허브 RN NDL	해밀턴 컴퍼니	7803-06	뇌 주사를 위해 Hamilton 주사기에 부착하기 위해
1ml BD 투베르쿨린 주사기	폭스바겐	BD309659	마취 및 식염수 투여용
30 게이지 바늘(0.5")	폭스바겐	BD305106	마취 및 식염수 투여용
휴대용 전자 CS 시리즈 저울 (오하우스)	폭스바겐	65500-202	마취 용량을 결정하기 위해 동물의 무게를 측정하기 위해
핫 플레이트(상단 플레이트 치수. 7.25x7.25인치)	폭스바겐	47751-148	수술 후 동물을 따뜻하게 하기 위해
Sofsilk 실크 봉합사 C-1 커팅 3/8, 12mm	코비디엔	S1173 (영어	상처 봉합용
Vetbond 티슈 접착제 (3M)	산타 크루즈 생명 공학	사우스캐롤라이나-361931	선택 사항: 상처 봉합 보조용; 봉합사와 함께 사용하십시오.
Cotton-Tipped Wooden-Shaft 멸균 애플리케이터	피셔 사이언티픽	Tel.22-029-488	수술 상처 세척 및 건조용
Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드	피셔 사이언티픽	제12-550-15	뇌 단면 수집을 위해
VWR 마이크로 커버 유리 24 X 50 mm	폭스바겐	48393241	현미경 슬라이드 장착용
Thermo Scientific Nalgene 주사기 필터 0.2 μm	피셔 사이언티픽	제194-2520	살균 식염수용
Viscot Medical의 멸균 듀얼 팁 스킨 마커	메드라인	VIS1422SRL91	두개골에 좌표를 표시하는 데 사용됩니다.

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