Primary Embryonic Mouse Dopamine Neurons에서 알파-시누클레인 축적 연구

Abstract

출처: Er, S. et al., 일차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런에서 미리 형성된 피브릴 유도 α-시누클레인 축적 연구.J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 알파-시누클레인 미리 형성된 섬유로 전처리된 배아 마우스 도파민 뉴런에서 알파-시누클레인 축적을 정량화하는 과정을 보여줍니다. 면역 형광을 사용하여 알파-시누클레인 응집체를 포함하는 도파민 뉴런을 고정, 염색 및 정량화하는 단계를 설명합니다.

Protocol

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 준비

1. DMEM/F12로 완성한 0.46% D-글루코스, 1% L-글루타민, 1% N2, 0.2% 프리모신으로 도파민 뉴런 배지(DPM)를 준비합니다. 재료를 혼합한 후 DPM을 필터링합니다. DPM을 4°C에서 보관하고 각 부분 표본을 한 번만 데웁니다.
   메모: DPM은 도파민 뉴런에서 α-synuclein 축적을 감소시키므로 glia-derived neurotrophic factor(GDNF)를 포함해서는 안 됩니다.
2. 극도로 소수성인 실리콘화된 유리 피펫을 준비하여 배아 뉴런의 초기 처리 중에 표면에 대한 부착 및 세포 손실을 최소화합니다.
   1. 증류수 1L에 실리콘화 유체 10mL를 넣고 2L 용기에서 교반하여 혼합합니다. 유리 피펫을 실리콘화 용액에 15분 동안 담근 상태로 둡니다.
   2. 증류수로 피펫을 3-5회 헹굽니다. 피펫을 실온(RT)에서 밤새 건조하거나 100-120°C로 가열된 멸균 공간에서 1-2시간 동안 건조하여 건조 속도를 높입니다.
   3. 밀봉된 오토클레이브 백에 표준 오토클레이브로 피
   펫을 소독합니다.
3. 뉴런 파종에 사용할 96웰 플레이트의 중간 웰에 60μL의 PO 용액을 첨가하여 바닥이 투명한 폴리-L-오르니틴(PO) 코팅된 96웰 플레이트를 준비하고, 가장자리 효과를 피하기 위해 플레이트 가장자리에 웰의 최소 1열/열을 남겨둡니다. 코팅된 플레이트를 4°C에서 하룻밤 동안 또는 실온에서 4시간 동안 유지하십시오.
4. 세포를 도금하기 전에 PO를 완전히 흡인하고 100μL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세 번 세척합니다. 웰에서 1x PBS를 흡입하고 완전한 건조를 위해 플레이트 뚜껑을 열어 둡니다.
   메모: 사용한 PO를 수집하고 재사용을 위해 필터링할 수 있습니다. 동일한 PO 솔루션에 대해 이 작업을 두 번 반복할 수 있습니다.
5. 이전에 코팅된 웰에 50μL의 DPM을 추가합니다. 100μL 플라스틱 팁으로 웰에서 DPM을 흡입하고 동시에 원을 그리며 웰 바닥을 긁어 각 웰 주변의 코팅을 제거합니다. PO 코팅된 섬은 우물 중앙에 남아 있습니다.
6. 층류 후드 아래에서 코팅된 각 아일랜드의 중간에 10μL의 DPM을 추가하여 마이크로 아일랜드를 만듭니다.
   메모: DPM으로 덮인 마이크로 아일랜드가 있는 플레이트는 세포를 분리하는 동안 1-2시간 동안 층류 후드 아래에 보관할 수 있습니다.

2. E13.5 마우스 배아로부터 복부 중뇌 기저부 분리

참고: 중뇌 바닥 박리 단계는 그림 1을 참조하십시오.

1. 해부하기 전에 10cm 페트리 접시에 Dulbecco의 완충액을 채우고 얼음 위에 보관하십시오.
2. 기관의 지침에 따라 E13.5 임신한 암컷 마우스를 안락사시킵니다. 마우스를 등에 평평하게 놓고 앞쪽 몸체에 70% 에탄올을 뿌립니다. 집게로 자궁 위의 피부를 들어 올리고 수술 용 가위로 절개하여 자궁을 드러냅니다.
3. 조심스럽게 자궁을 제거하고 미리 준비한 얼음 위의 페트리 접시에 넣습니다.
4. RT에서 층판 후드 아래의 수술용 가위를 사용하여 자궁에서 배아를 조심스럽게 제거합니다. 겸자로 배아에서 모든 태반 잔여물을 제거하고 Dulbecco의 완충액으로 채워진 새로운 10cm 페트리 접시에 넣습니다.
5. 해부 집게나 바늘을 사용하여 그림 1A에서 검은색 화살표로 표시된 위치에서 머리의 뒷부분을 잘라냅니다. 절단된 조각을 배아의 나머지 부분에서 분리합니다(그림 1B).
6. 절단된 조각의 뒤쪽을 관찰자 쪽으로 놓고(그림 1C) 꼬리에서 두개골까지 부드럽게 잘라냅니다(그림 1D). 두개골 개구부 아래 0.5mm에서 그림 1E와 같이 2mm 2-3mm2 영역을 자릅니다.
7. 빈 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 복부 중뇌 바닥(그림 1F 참조)을 수집합니다. 모든 중뇌 바닥이 모일 때까지 마이크로 원심분리기 튜브를 얼음 위에 두십시오.
   메모: 또는 모든 배아 뇌를 해부한 후 1mL 마이크로피펫으로 중뇌 기저를 수집할 수 있습니다.

3. 96 웰 플레이트 형식의 E13.5 마우스 배아에서 1차 배아 중뇌 배양 확립

1. 동일한 1.5 mL 튜브에 모든 배아의 중뇌 기저부를 채취한 후, 잔류 둘베코 완충액을 제거하고 조직 조각을 500 μL의 Ca²⁺, Mg²⁺-free Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)으로 세 번 세척합니다.
2. HBSS를 제거하고 튜브에 0.5% 트립신 500μL를 추가합니다. 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
3. 배양 중 1.5mL의 소 태아 혈청(FBS)을 37°C에서 가열하고 FBS에 30μL의 DNase I을 첨가하고 혼합합니다. 또한 실리콘화된 유리 피펫의 끝을 불로 연마합니다. 구멍에 날카로운 모서리가 없고 1mL 마이크로피펫 팁과 거의 같은 크기인지 확인하십시오.
   참고: 대안으로, 낮은 접착력 1mL 마이크로피펫 팁을 trituration에 사용할 수 있습니다. 그러나 실리콘 유리 피펫이 최상의 결과를 제공하는 것 같습니다.
4. 3.2단계의 배양이 끝나자마자 부분적으로 분해된 조직에 FBS/DNase 혼합물 500μL를 첨가합니다. 유리 피펫을 사용하여 FBS/트립신 혼합물의 조직을 분쇄합니다. 조직이 거의 보이지 않는 작은 입자로 해리될 때까지 삼중화합니다. trituration 동안 거품을 피하십시오.
5. 남은 입자가 중력에 의해 미세 원심분리기 튜브의 바닥에 침전되도록 합니다. 바닥에 있는 침전물을 피펫팅하지 않고 상층액을 빈 15mL 원추형 폴리프로필렌 튜브에 모읍니다.
6. 3.3단계(98:2)의 FBS/DNase I을 1,000μL의 HBSS로 희석하여 FBS/DNase-I/HBSS(49:1:50)를 얻습니다. 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 1,000μL의 새 혼합물을 마이크로 원심분리기 튜브의 남은 입자에 추가합니다. 다시 트라이추얼하고 3.5단계를 반복합니다.
7. 이전 단계를 한 번 더 반복하여 모든 FBS/DNase-I/HBSS(49:1:50)를 모두 사용합니다.
8. 모든 상등액이 15mL 튜브 내부에 수집되면(3.5, 3.7 및 3.8 단계에서) 탁상용 원심분리기를 사용하여 100 x g에서 5분 동안 상층액(~3mL)을 회전시킵니다. 바닥의 펠릿화된 세포를 건드리지 않고 상층액을 제거합니다.
9. 튜브에 DPM 2mL를 추가하여 세포 펠릿을 세척하고 100 x g에서 5분 동안 스핀다운합니다. 상층액을 제거하고 세척을 2회 반복하여 펠릿화된 세포의 파편을 최소화합니다.
   참고: 배양된 뉴런에는 항상 신선하고 따뜻한 DPM을 사용하십시오. 세척 단계의 경우 DPM이 신선할 필요는 없지만 37°C로 예열해야 합니다.
10. 신선하고 따뜻한 DPM으로 세포를 희석하고 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 희석을 위한 DPM의 양은 조직 해부에 사용되는 배아의 수에 따라 다릅니다. 예를 들어, 150μL의 DPM을 사용하여 10개의 배아에서 얻은 세포를 희석합니다.
11. DPM에 있는 세포 10μL를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 10μL의 0.4% 트리판 블루 염색제와 혼합합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 살아있는(즉, Trypan blue negative) 세포를 계수합니다.
    참고: 웰당 30,000개의 세포를 사용하여 웰당 ~1,000개의 도파민 뉴런을 얻습니다. 세포 밀도가 6 μL당 ~30,000 세포보다 높으면 파스딩 부피가 6 μL 이상이 되도록 도금하기 전에 DPM으로 세포를 더 희석합니다.
12. 웰의 바닥을 건드리지 않고 1.6단계에서 생성된 마이크로 아일랜드에서 DPM을 제거합니다.
13. 각 웰에서 재현 가능한 세포 밀도를 얻으려면 웰에서 도금하기 전에 부드러운 피펫팅으로 세포를 혼합합니다. 1–10 μL 마이크로피펫을 사용하여 6 μL의 세포를 각 이전 마이크로 아일랜드의 위치에 있는 웰 중앙에 추가합니다.
14. 플레이트 가장자리의 빈 웰에 150μL의 물 또는 1x PBS를 채워 뉴런 배양이 포함된 웰의 증발을 최소화합니다. 37 ° C, 5 % CO₂ 1 시간 동안 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다.
15. 1시간 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 세포가 있는 각 웰에 DPM 100μL를 추가한 다음 인큐베이터에 다시 넣습니다.
16. 도금 2일 후(시험관 내 2일 또는 DIV2) 25μL를 제거하고 75μL의 새로운 DPM을 추가하여 최종 배지 부피를 150μL로 만들고 가능한 한 증발을 방지합니다.
17. DIV5에서 배지의 절반을 새 DPM으로 교환합니다(즉, 75μL를 제거하고 75μL의 새 DPM을 추가). DIV5 이후에는 미디어 변경을 수행하지 마십시오.

4. 미리 형성된 섬유로 파종하여 1차 배아 도파민 뉴런에서 α-synuclein 응집체 유도

α-synuclein 미리 형성된 피브릴(PFF)에 대한 작업을 수행한 후 층류 후드 또는 PFF와 접촉했을 수 있는 장비를 1% 도데실황산나트륨(SDS)과 접촉한 다음 70% 에탄올로 청소합니다.

1. 실험에 앞서 PFF를 1x PBS로 최종 농도 100μg/mL로 희석합니다. 수조 초음파 발생기를 사용하여 수조 초음파 발생기를 사용하여 고출력으로 희석된 PFF를 초음파 처리하여 4°C에서 10사이클, 30초 ON/30초 OFF.
   메모: 원섬유가 ~50nm 길이의 단편을 생성하기 위해 적절하게 초음파 처리되는 것이 중요합니다. 초음파 처리 된 PFF의 크기는 염색 된 PFF의 투과 전자 현미경 이미지에서 직접 측정 할 수 있습니다. 초음파 처리는 고출력 수조 초음파 처리기에서 위에서 설명한 바와 같이 달성 될 수 있습니다. 또는 팁 초음파 처리기를 사용할 수 있습니다. 초음파 처리된 PFF는 여러 번의 동결/해동 주기를 피하기 위해 -80°C에서 작은 부분 표본으로 보관할 수 있습니다.
2. DIV8에서 웰당 100μg/mL PFF 3.75μL를 웰의 150μL 배지에 최종 농도 2.5μg/mL까지 추가합니다. 통제 그룹에 대해 동일한 양의 1x PBS를 사용합니다.
3. 1x PBS에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비하고 부분 표본을 -20°C에서 보관합니다. 이렇게 하려면 아래 단계를 따르세요.
   참고: PFA는 독성이 있습니다. 준비하는 동안 마스크와 장갑을 착용하고, 항상 층류 후드 아래에서 작업하고, 기관의 지침에 따라 모든 고체 및 액체 PFA 폐기물을 처리합니다.
   1. 1L 용기에 500mL의 1x PBS를 넣고 데웁니다. 용기에 교반 막대를 넣고 가열 기능이 있는 자석 교반기에 용기를 올려 놓습니다. 용액을 따뜻하게 유지하면서 끓는 것을 방지하기 위해 온도를 40–60 °C 사이로 조정하십시오.
   2. 일회용 플라스틱 측정 용기의 후드 아래에서 PFA 분말 20g을 측정합니다. 1x PBS로 채워진 용기에 PFA 분말을 조심스럽게 첨가합니다. 용액을 저어주기 시작합니다.
   3. 용액에 200μL의 5M 수산화나트륨을 넣고 PFA가 완전히 용해될 때까지 ~15분 동안 계속 저어줍니다.
   4. 용액이 균일한 것으로 나타나면 168μL의 5M 염화수소를 첨가하여 pH의 균형을 ~7로 조정합니다. 일회용 색상 고정 pH 지시약 스트립으로 pH를 확인하십시오.
   5. 히터에서 용기를 제거하고 RT로 식히십시오. -20 ° C에서 보관하기 위해 용액과 부분 표본을 여과합니다. 사용하기 전에 RT에서 부분 표본을 해동하고 나중에 다시 얼리지 마십시오.
4. DIV15에서 피펫팅으로 웰에서 모든 매체를 제거합니다. 각 웰에 50μL의 4% PFA를 첨가하여 세포를 고정하고 RT에서 20분 동안 배양합니다. 배양 후 웰에서 PFA를 제거하고 각 웰에 100μL의 1x PBS를 첨가하여 세포를 세척합니다. 1x PBS를 제거하고 2배 더 씻으십시오.
5. 건조를 방지하기 위해 각 웰에 100μL의 1x PBS를 그대로 두십시오. 면역화학이 수행될 때까지 플레이트를 4°C에서 보관하십시오.

5. 96개의 웰 플레이트에서 1차 배아 도파민 뉴런의 면역형광 염색 및 자동 이미징

1. 1x PBS를 제거하고 웰당 PBS(PBST)에 0.2% Triton X-100 100μL를 첨가하고 실온에서 15분 동안 배양하여 세포를 투과화합니다.
2. PBST를 제거하고 PBST에 웰당 50μL의 5% 정상 말 혈청(NHS)을 첨가합니다. 비특이적 항원 활성을 차단하려면 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
3. 티로신 하이드록실라제(TH) 및 pS129-αsyn(1:2,000)에 대한 1차 항체를 PBST의 5% NHS에 희석합니다. 각 웰에 50μL의 희석된 항체를 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
4. 항체를 제거하고 각 웰에 100μL의 1x PBS를 첨가하여 세포를 세척합니다. 1x PBS를 제거하고 2x 세탁을 반복합니다.
5. 형광 분자의 표백을 방지하려면 최소한의 조명 조건에서 작업을 시작하십시오. 2차 형광 표지 항체(1:400)를 PBST에서 희석합니다. 각 웰에 희석된 항체 50μL를 추가하고 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
6. 항체 용액을 제거하고 각 웰에 1x PBS 100μL를 첨가하여 세포를 세척합니다. 1x PBS를 제거하고 2x 세탁을 반복합니다.
7. 1x PBS를 제거하고, 웰당 200ng/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 50 μL를 첨가하여 배양된 세포의 핵을 염색하고, RT에서 10분 동안 배양합니다.
8. 100μL의 1x PBS로 셀을 각각 5분 동안 3x 세척합니다. 마지막 세척 후 각 웰에 100μL의 1x PBS를 보관하십시오. 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 이미징할 때까지 4°C에서 보관합니다.
9. 10x 대물렌즈가 장착된 high-content plate 스캐너(Table of Materials) 참조가 있는 96 well view plate의 1차 배아 도파민 뉴런 이미지.
10. 플레이트 유형, 제조업체, 크기, 웰 간 거리, 매체의 유형 및 양과 같은 96웰 플레이트의 사양에 따라 설정을 조정합니다.
11. 마이크로 아일랜드의 모든 세포를 덮을 웰의 이미징 영역을 선택합니다. 예를 선택하십시오.amp자동 초점을 조정하려면 잘 선택하십시오. 초기에는 DAPI에 초점을 맞춥니다.
12. control well의 염색 강도에 따라 각 형광 채널의 수집 시간을 보정합니다. PFF 처리된 대조군 웰에서 세포 소마에 pS129-αsyn 응집체가 있는 도파민 세포를 명확하게 구별할 수 있도록 매개변수를 조정하여 pS129-αsyn 양성 세포와 pS129-αsyn 음성 세포를 명확하게 정량화할 수 있습니다.
    메모: PFF를 포함하지 않는 웰에는 pS129-αsyn에 대한 염색이 없어야 합니다. 따라서 이러한 웰은 pS129-αsyn 강도를 조정하기 위한 음성 대조군으로 사용할 수 있습니다.
13. 정확히 동일한 파라미터로 면역형광 염색을 하는 모든 채널에 대해 10x 대물렌즈로 선택한 모든 웰을 동시에 이미징합니다.
14. 선택적으로, 필라멘트 α-synuclein에 특이적인 항체가 있는 웰의 하위 집합에 α-synuclein 개재물을 라벨링하여 pS129-αsyn-양성 개재물 수의 변화가 pS129-αsyn의 인산화 또는 탈인산화의 억제가 아닌 단백질 축적의 감소를 반영하는지 확인합니다.
15. 5.3단계를 반복하여 pS129-αsyn 항체를 α-synuclein 필라멘트 항체(1:2,000)로 치환합니다. 5.13단계에서와 같이 염색된 응집된 α-synuclein을 이미지화합니다.

Results

그림 1: E13.5 마우스 배아의 중뇌 기저부 해부.(A) 머리 뒤쪽의 절단 위치는 검은색 화살표와 흰색 점선으로 표시되어 있습니다. (B) 배아의 나머지 부분에서 조각을 제거했습니다. 제거된 조각은 원으로 표시됩니다. (C) 조각이 관찰자를 향하여 후방을 향하도록 90° 회전했습니다. (D) 조각은 꼬리에서 두개골까지 검은 화살표로 열렸습니다 (흰색 점선으로 표시). (E) 개구부 아래 0.5mm-1mm에서 2mm 2-4mm2 영역을 절단했습니다(검은색 선으로 표시). (F) 복부 중뇌 바닥이 고립...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% 트리판 블루 스테인	Gibco, Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	15250061
15ml CELLSTAR 폴리프로필렌 튜브	Greiner Bio-One GmbH, 프리켄하우젠, 독일	188261
4', 6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)	시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스	10236276001
5 M 염산	해당 사항 없음	해당 사항 없음	미디어 키친, 헬싱키 대학교 생명 공학 연구소
5M NaOH	해당 사항 없음	해당 사항 없음	미디어 키친, 헬싱키 대학교 생명 공학 연구소
96웰 뷰플레이트(블랙)	PerkinElmer, 미국 매사추세츠주 월섬	6005182
99.5% 에탄올(EtOH)	Altia Oyj, Rajamäki, 핀란드	해당 사항 없음
AquaSil 실리콘화 유체	Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	TS-42799
오토클레이브 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브	해당 사항 없음	해당 사항 없음	미디어 키친, 헬싱키 대학교 생명 공학 연구소
Bioruptor 초음파 처리 장치	Diagenode, 리에주, 벨기에	B01020001
Ca2+, Mg2+ 무함유 행크스 균형 소금 용액(HBSS)	Gibco, Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	제14175-053
CellProfiler 및 CellAnalyst 소프트웨어 패키지	해당 사항 없음	해당 사항 없음	무료 오픈 소스 소프트웨어
원심분리기 5702	Eppendorf AG, 함부르크, 독일	5702000019
CO2 인큐베이터	HeraCell, Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	해당 사항 없음
계수 챔버	BioRad Inc., 미국 캘리포니아주 허큘리스	1450015
DeltaVision 초고해상도 현미경(에어 테이블 및 캐비닛 포함	GE Healthcare Life Sciences, 미국 매사추세츠주 보스턴	29254706
데옥시리보뉴클레아제-I(Dnase I)	Roche, Basel, 스위스	22098700
D-포도당	시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스	G8769 (영문
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	21331–020
당나귀 안티 마우스 AlexaFluor 488	Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	A21202
당나귀 안티 토끼 AlexaFluor 647	Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	A31573 (영문
당나귀 안티 양 AlexaFluor 488	Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	A11015
둘베코의 버퍼	해당 사항 없음	해당 사항 없음	미디어 키친, 헬싱키 대학교 생명 공학 연구소
소 태아 세럼(FBS)	Gibco, Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	10500056
Fisherbrand 플레인 이코노미 PTFE 교반 바	fisher scientific, Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	11507582
ImageXpress Nano 자동 이미징 시스템	Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 산호세	해당 사항 없음
L-글루타민	Gibco, Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	25030–032
마우스 단클론 항티로신 하이드록실라제	Millipore, Merck KGaA, 다름슈타트, 독일어	MAB318
N2 보충제	Gibco, Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	17502년–048
노멀 호스 세럼	Vector Laboratories Inc., 벌링게임, 캘리포니아, 미국	에스-2000
파라포름알데히드(PFA)	시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스	158127
파라포름알데히드 분말, 95%	시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스	158127
pH-Fix, 색상 고정 표시기 스트립	Macherey-Nagel, 뒤렌, 독일	92110
인산염 완충액 식염수(PBS)	해당 사항 없음	해당 사항 없음	미디어 키친, 헬싱키 대학교 생명 공학 연구소
폴리-L-오르니틴	시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스	P4957
프리모신	InvivoGen, 미국 캘리포니아주 샌디에이고.	개미-PM-1, 개미-오후-2
토끼 단클론 안티 알파-시누클레인 필라멘트	Abcam, 케임브리지, 영국	AB209538
토끼 단클론 안티 포스파 - 세린 129- 알파 - 시누클레인	Abcam, 케임브리지, 영국	AB51253
RCT Basic, IKA 마그네틱 교반기	IKA-Werke® GmbH, 슈타우펜, 독일	3810000
재조합 인간 신경교세포 유래 신경영양인자(hGDNF)	PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 또는 Prospec, Ness-Ziona, Israel	450-10 (페프로텍), CYT-305 (프로스펙)
재조합 마우스 알파 시누클레인 사전 성형 피브릴(PFF)	해당 사항 없음	해당 사항 없음	공동 연구자인 Kelvin C Luk 교수의 선물
연구용 실체현미경 시스템	Olympus Corporation, 일본 도쿄	SZX10
양 polyclonal anti-tyrosine hydroxylase	Millipore, Merck KGaA, 다름슈타트, 독일어	AB1542
TC 20 자동 세포 계수기	BioRad Inc., 미국 캘리포니아주 허큘리스	1450102
트리톤 X-100	시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스	11332481001
트립신	MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, 중국	2199700