국소 뇌허혈을 유발하기 위해 새끼 쥐에서 중대뇌동맥 폐색을 생성하는 것

초록

출처: Larpthaveesarp, A., et. al입니다. P10 쥐에서 신생아 뇌졸중의 일시적인 중간 대뇌 동맥 폐색 모델. J. Vis. 특급. (2017)

이 비디오는 새끼 쥐에서 Middle Cerebral Artery Occlusion 모델을 설정하는 방법을 보여줍니다. 내부 경동맥(ICA)이 노출되고 결찰자가 고정되어 혈액 범람을 제한합니다. 폐색은 ICA를 통해 삽입되어 중대뇌동맥에 도달합니다. 그런 다음 추가 분석 전에 강아지가 회복할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 중대뇌동맥 폐색

1. 강아지의 무게를 측정하고 적절한 체중(19-21g)인지 확인합니다. 100% 산소(O₂)에 3% 이소플루란을 섞어 강아지를 마취하고 발 꼬집음에 대한 반응이 없는지 확인합니다. 수술 단계 아래에 발열 패드를 사용하여 체표면 온도를 35.5°C에서 37°C 사이로 유지하십시오.
2. 어깨 부위에 테이프를 붙여 동물을 누운 자세로 고정합니다. 멸균 면봉을 사용하여 포비돈 요오드 용액으로 경추 앞쪽을 면봉으로 닦은 다음 이중 증류수에 70% 에탄올을 넣은 면봉을 총 4개의 면봉에 대해 각 용액을 번갈아 가며 닦습니다.
3. 계획된 절개 부위에 0.25% 부피바카인을 국소적으로 침투시킵니다. 입체경을 사용하여 정중선을 5-7mm 전방 경추 절개를 만들어 총경동맥(CCA)을 노출시킵니다. 2-4개의 견인기를 배치하여 캐비티를 열고 동맥을 노출시킵니다.
4. 내부 경동맥(ICA), 후두 동맥(OA) 및 외부 경동맥(ECA)을 찾습니다. 명확한 시야를 얻기 위해 동맥을 손질하십시오. 미주 신경을 방해하지 않도록 주의합시다.
   참고: 가짜 수술을 받은 새끼의 경우, 절개 부위를 열어 두고 동맥을 노출시킨 후 절개 부위를 봉합합니다. 총 마취 시간은 폐색 수술의 시간과 동일합니다.
5. 6-0 실크 꼰 봉합사 1.5 cm를 자릅니다. 봉합사를 풀어 한 가닥을 당겨 빼냅니다. 한 가닥이 깔끔하고 닳지 않았는지 확인하십시오.
   참고: 필요한 경우 단일 가닥을 멸균수에 담그고 집게 끝으로 가닥을 손질하여 닳은 끝을 매끄럽게 합니다.
6. 45도 겸자로 봉합사 가닥을 잡으면서 집게를 호를 그리며 움직여 ICA 아래로 이동하여 집게 끝이 ICA와 OA 사이에 나오도록 합니다.
   참고: 해부가 잘 이루어진다면 이 단계는 비교적 쉬울 것입니다. ICA와 OA가 접촉하는 경우 겸자를 사용하여 ICA를 분리할 때 동맥이 파열되지 않도록 주의하십시오. 출혈이 발생하면 출혈이 멈출 때까지 겸자로 동맥에 압력을 가하십시오. 멸균 면봉으로 혈액을 흡수합니다.
7. 집게로 잡고 있는 봉합사 가닥의 끝을 잡고 끝이 쉽게 접근할 수 있도록 당깁니다. 1.5단계에서 동작을 반대로 하여 겸자에서 가닥을 풀고 ICA 아래에서 겸자를 뒤로 빼냅니다(그림 1A).
8. CCA와 분리되는 위치에 가장 가까운 기저부의 ICA 주위에 임시 합자를 묶습니다.
   참고: 매듭을 풀기 위해 당길 가닥의 끝이 집게로 쉽게 잡을 수 있을 만큼 충분히 길도록(1mm 초과, 3mm 미만) 매듭을 묶는 것이 중요하며, 매듭의 다른 쪽에 수축을 위한 적절한 양의 봉합사 가닥이 있는지 확인하십시오. 위치
9. ICA를 측면으로 조심스럽게 집어넣고 클립을 사용하여 절개 부위 반대쪽 겨드랑이 부위 근처의 여분의 피부에 가닥을 고정합니다. 조절되지 않는 출혈의 위험을 최소화하기 위해 다음 단계로 진행하기 전에 이 수축 가닥이 혈류를 멈출 수 있을 만큼 충분히 팽팽한지 확인하십시오. 동맥이 평평하고 창백한 것을 관찰하십시오.
   참고: ICA의 부분적 또는 완전한 중단을 유발할 수 있으므로 과도하게 철회하지 마십시오. 동맥 절개술을 하기 직전에 클립과 반대쪽에 있는 가닥을 당겨 수축을 조정할 수 있습니다.
10. 45° 집게를 사용하여 꼰 다른 봉합사 가닥을 잡고 1.5단계와 같이 ICA 아래 및 주위에 고리를 만듭니다. 이 스트랜드를 후퇴 스트랜드 측면으로 배치합니다(그림 1B).
    참고: 이 단계는 철회 전에도 수행할 수 있습니다. 후퇴의 품질에 대해 확신이 없는 경우 이 매듭은 다음 단계 전에 매우 느슨하게 묶일 수 있습니다.
11. 묶인 합자와 묶이지 않은 합자 사이의 중간에서 0.2mm 동맥 절개술을 절단하여 묶인 합자에 더 가깝게 오류를 범합니다.
    참고: 묶인 동맥에 남아 있는 혈액은 동맥 절개술을 통해 비워질 수 있지만 5μL를 초과해서는 안 됩니다. 출혈이 지속되면 과도한 긴장으로 동맥이 손상되지 않도록 주의하면서 수축 가닥을 조심스럽게 당겨 수축을 증가시킵니다.
12. 미터법 자를 사용하여 폐색 봉합사를 측정하고 재관류 중에 폐색을 제거하기 위해 2-3mm의 추가 여유로 봉합사를 절단합니다. 45도 겸자로 가림대를 잡고 직선 집게를 사용하여 MCA에 도달하기 위한 적절한 길이로 구부리고 전진을 위한 정지 지점을 표시합니다.
    참고: 실리콘 팁 끝에서 굽힘까지의 10mm 폐색 길이는 이 체중 범위의 출생 후 또는 P-10 Sprague Dawley 또는 Long Evans 새끼 쥐에 사용됩니다.
13. 45° 집게를 사용하여 실리콘으로 코팅된 나일론 폐색 봉합사를 동맥절개술에 공급하고 MCA까지의 미리 결정된 거리를 표시하는 구부러진 부위까지 봉합사를 전진시킵니다(그림 1C). 진급이 원활하게 느껴지도록 합니다. 저항이 느껴지면 즉시 전진을 중지하십시오. 전진 중에는 CC/ECA와 평행한 방향으로 머리를 향해 봉합사를 조준합니다.
    참고: 봉합사가 동물의 척추 쪽으로 등쪽으로 전진하면 익상구개 동맥(PTA)으로 들어갈 수 있습니다. 3-5mm 전진 후 저항이 느껴지면 봉합사가 PTA 접합부에 부딪힌 것입니다. 전진 방향을 조정하기 전에 실리콘 헤드가 동맥 절개술 근처에 올 때까지 동맥에서 폐색을 뒤로 빼냅니다. 동맥 절개술에서 폐색을 완전히 제거할 필요는 없습니다.
14. 1.10단계의 스트랜드를 사용하여 임시 합자를 묶어 가림판을 고정합니다(그림 1D).
15. 견인기 클립을 제거합니다. 매듭을 제거하기 위해 당기는 매듭의 가닥이 곧은 집게로 잡기 쉽고 매듭을 조이기 위해 당기는 가닥보다 길도록 두 임시 결자의 가닥을 자릅니다.
    참고: 가닥은 닫힌 후 구멍에서 엉키지 않도록 충분히 짧아야 합니다.
16. 견인기를 제거하고 6-0 꼰 실크를 사용하여 캐비티를 닫아 3-4개의 단속 봉합사를 만듭니다.
17. 강아지를 마취에서 제거하고 실내 공기가 있는 가열 패드에 올려 놓습니다. 강아지가 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 모니터링하고, 댐으로 돌려보내기 전에 완전히 회복되었는지 확인하십시오. 강아지의 체표면 온도가 35.5°C에서 37°C 사이로 유지되는지 확인하십시오.

결과

그림 1: tMCAO 시술의 실시간 수술 이미지. (A) 첫 번째 봉합사 가닥은 1.6단계에서 자세히 설명한 대로 ICA 주위를 고리로 감습니다. (B) 첫 번째 임시 합자가 묶이고 ICA가 후퇴합니다. 두 번째 봉합사 가닥은 1.9단계에서 자세히 설명한 대로 첫 번째 봉합사 가닥 측면의 ICA 주위를 고리로 감습니다. (C) 실리콘으로 코팅된 폐색 봉합사는 1.12단계에서 자세히 설명한 대로 동맥 절개술 부위에 공급됩니다. (D) 두 번째 임시 합자는 1.14단계에서 자세히 설명한 대로 가림판을 제자리에 고정하기 위해 묶입니다. 축척 막대 = 1mm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Isoflourane	Henry Schein	50033	마취제, at 3
삼안 Surgioscope	World Precision Instruments	PSMT5N
가열 패드	Sunbeam	000731-500-000	낮음에서 중간 설정
IR 온도계	Extech Instruments	72-5270
작은 동물을 위한 수축 키트	Fine Science Tools	18200-20
CermaCut 가위	Fine Science Tools	14958-09
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	2x
Fine Science Tools	11251-35
Fine Science Tools	00398-02
Forcepts for Clamp Application<	00072-14
Micro Vannas Scissors	Fine Science Tools	15000-03	2mm 커팅 엣지
폐합사	Doccol	602123PK10	701712PK5Re
자	Fine Science Tools
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture	Ethicon	769G
Euthasol	Virbac	710101	0.22 ml/kg
면 팁 애플리케이터	Henry Schein	100-9249
Laboratory Tape	VWR	89097-990

% < td style = '너비 : 152pt; '>112522-00 < td 스타일 = '높이 : 14.5pt; 너비 : 149pt; '> Dumont # 5 / 45 Forceps< td 스타일 = '너비 : 190pt; '> 2x < td 스타일 = '높이 : 14.5pt; 너비 : 149pt; '>B-2 마이크로 클램프td style='width:148pt;'>Fine Science Tools