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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 초상자성 산화철(SPIO) 나노입자로 중간엽 줄기 세포(MSC)를 표지
하기
- 위해 6mL의 표지 배지(태아 소 혈청(FBS)가 없는 Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM)에 25μg/mL의 SPIO)를 중간엽 줄기세포(80% 합류)가 포함된 T75 플라스크에 추가합니다.
- 흔들지 않고 CO2 인큐베이터 (37 °C, 5 % CO2)에서 라벨링 배지와 함께 세포를 배양합니다. 24시간 후, 진공 장치에 플라스틱 팁이 부착된 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 라벨링 매체를 부드럽게 제거합니다. 6mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 단층으로 2배 세척하여 내재되지 않은 SPIO의 흔적을 제거합니다.
- 세포가 성공적으로 라벨링되었는지 확인하려면 SPIO가 형광단으로 태그가 지정된 경우 형광 현미경 또는 공초점 현미경으로 라벨링된 세포를 확인하십시오(즉, 여기에 사용된 것과 같이; 그림 1B, C).
- 3mL의 트립신으로 처리하여 부착 세포를 수확하고 37°C에서 배양합니다. 배양 5분 후, 10% FBS(v/v)와 함께 예열된 DMEM 배지 7mL를 첨가하여 트립신을 비활성화합니다. 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 15mL 원추형 튜브에 수집합니다.
- 세포 현탁액을 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 PBS에 재현탁합니다. 트리판 블루 염료와 혈구계를 사용하여 생존 세포를 계산합니다.
참고: 표지된 세포의 세포 펠릿은 철분 부하로 인해 어두운 색으로 나타납니다(그림 1D). 이 프로토콜은 MSC 라벨링 및 자기공명영상(MRI)과 관련이 있습니다. MSC 라벨링 절차는 이전에 최적화되었으며, 생체 내 추적이 초점이기 때문에 생체 내에서 추적하기 위해 라벨링된 MSC를 준비하는 단계만 여기에 포함됩니다. 다른 세포 유형의 배양 및 라벨링을 위한 프로토콜은 연구원이 최적화해야 합니다. - PBS를 사용하여 세포 농도를 18μL의 PBS(또는 비강내 전달 절차에 사용될 총 부피)에서 150,000개의 세포(또는 충분한 MRI 신호를 생성하는 숫자)로 조정합니다.
참고: 150,000개 세포/18μL의 PBS보다 높은 세포 농도는 세포 응집을 유발하는 것으로 나타났습니다. 비강내 전달의 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다. 비강내 투여를 위해 더 많은 수의 세포가 필요한 경우 비강내 투여는 비침습적 절차이며 다중 투여가 가능하므로 세포 현탁액의 총 부피를 늘리고 비강내 투여 횟수를 늘립니다.
2. 제어된 피질 충격(CCI) 손상
참고: 이 프로토콜에서 수컷 C57 BL/6 마우스(7-8주령)를 음식과 물에 자유롭게 접근하는 12/12시간 빛/암순 주기로 유지했습니다.
- CCI 손상에 대해 각 마우스를 준비하기 위해 복강내(i.p.) 주사(1mL/kg)를 통해 졸라제팜(50mg/kg) 및 자일라진(20mg/kg) 마취 칵테일을 투여합니다. 발가락 꼬집기 반응이 없어 마취 깊이가 충분한지 확인하십시오. 또는 마우스를 2%–4% 이소플루란이 공급된 챔버에 60초 동안 놓습니다.
- 전자 이발기를 사용하여 귀 사이의 두개골 등쪽 표면의 털을 면도합니다. 요오드에 적신 멸균 면봉을 사용하여 면도한 부위를 여러 번 청소하십시오. 70% 에탄올에 적신 면봉을 사용하여 요오드를 제거합니다.
- 마취된 마우스를 정위 프레임에 놓고 이어 바와 코 바를 사용하여 마우스를 고정합니다. 멸균 가위를 사용하여 면도한 피부에 중간 시상 절개(약 2.5cm)를 하여 두개골 표면에 접근합니다.
- 면봉을 사용하여 뼈의 조직을 제거하여 두개골을 노출시킵니다. 3% 과산화수소(H2O2)에 적신 면봉을 사용하여 두개골 표면을 10초 동안 청소한 다음 마른 화장솜으로 청소합니다.
참고: 이제 두개골 봉합사와 브레그마와 람다를 쉽게 식별할 수 있습니다. - CCI 손상에 대해 두개골 표면에서 선택한 좌표를 식별하고 연필이나 적절한 마커를 사용하여 좌표 주위에 원(직경 4mm)을 그립니다.
참고: 이 프로토콜에서는 전후방(AP) -2.0mm 및 내측(ML) +1.5mm의 좌표가 CCI 유도에 사용되었습니다. - 마이크로드릴과 둥근 버(직경 0.5mm)를 사용하여 표시된 원에서 두개골을 얇게 만듭니다. 뼈를 뚫으면 뇌 실질이 손상될 수 있으므로 드릴링하는 동안 압력을 가하지 마십시오. 깨끗하고 마른 면봉을 사용하여 뼈 가루를 닦아냅니다.
- 멸균 미세 겸자를 사용하여 뼈 플랩을 부드럽게 제거하여 경막을 손상되지 않은 상태로 노출시킵니다. 부상 전 준비에 사용된 정위 프레임에서 마우스를 제거하고 CCI 장치의 정위 프레임에 넣습니다.
- 이어바와 노즈 바를 사용하여 마우스 머리를 안정시킵니다. 마우스 머리가 주둥이-꼬리 방향으로 수평인지 확인하고 필요한 경우 노즈 바를 조정합니다.
- 컨트롤 박스의 지침에 따라 임팩터 팁을 노출된 피질 표면에 영점화합니다. 임팩터 팁이 임팩터 바닥의 X 및 Y 컨트롤 휠을 사용하여 임팩터를 받을 원하는 피질 좌표 바로 위에 정렬되어 있는지 확인하십시오.
컨트롤 - 박스를 사용하여 속도 5m/s, 체류 시간 250ms, 손상 깊이 1mm로 실험 매개변수를 설정하여 마우스에 경미한 손상을 유도합니다.
- 컨트롤 박스의 '충격' 버튼을 눌러 부상을 유발합니다. 멸균 면봉을 사용하여 출혈이 발생한 경우를 면봉으로 닦으십시오.
- 정위 프레임에서 마우스를 제거하고 실크 수술용 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다. 마우스가 MRI를 위해 자기장에 노출되므로 금속 클립을 사용하여 수술 부위를 닫지 마십시오.
- 감염을 예방하기 위해 수술 부위에 국소 항생제(바시트라신 네오마이신)를 도포하십시오. 마우스를 가열 패드 위에 놓고 복구 단계에서 면밀히 모니터링하십시오.
- 케토프로펜 투여가 연구 목표와 모순되지 않는 한 수술 후 3일 동안 매일 케토프로펜(2.5mg/kg, IP)을 투여합니다.
3. 비강내 전달
- CCI 유도 후 1일 후 i.p. 주사를 통해 졸라제팜(50mg/kg)과 자일라진(20mg/kg) 마취 칵테일을 투여합니다. 마우스가 발가락 꼬집기 반응 부족으로 인해 깊은 마취를 받았는지 확인하십시오.
- 히알루로니다제 치료에 의한 중간엽 줄기세포의 비강내 전달을 위해 마우스를 준비합니다.
쥐- 의 목덜미를 잡고 두개골을 고정한 상태에서 등을 단단히 돌립니다. 히알루로니다제가 포함된 피펫의 끝을 멸균 PBS(4U/μL)에 마우스의 콧구멍 근처에 45° 각도로 놓습니다.
- 각 콧구멍에 3μL의 히알루로니다제 현탁액을 투여합니다. 마우스를 고정하고 깨끗한 패드 위에 5분 동안 위쪽을 향하게 합니다. 히알루로니다제 치료를 4회 반복합니다(총 100U 히알루로니다제 현탁액).
- 히알루로니다제 치료 후 처리된 마우스를 깨끗한 패드에 30분 동안
위로 향하게 둡니다.- MSC를 뇌로 전달하려면 3.2.1단계에 설명된 대로 마우스를 단단히 잡습니다. 3초 간격으로 3μL/코구멍의 MSC 현탁액을 투여합니다. 샘플 방울이 완전히 사라질 때까지 30초 동안 마우스를 같은 위치에 유지합니다.
참고: 투여 중 기포가 형성되지 않도록 하십시오. 최대 - 3x까지 2분 간격으로 투여를 반복합니다.
참고: 전달할 총 세포 수는 150,000개이며, 따라서 18μL의 세포 현탁액은 각 콧구멍에 대해 3μL 용량으로 각각 3배씩 전달될 수 있습니다. - 마우스를 케이지로 되돌리고 마취에서 완전히 회복될 때까지 면밀히 모니터링합니다.
