깨어 있는 쥐에서 운동 피질의 경두개 전기 자극

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수술 절차: 흉부 전극 이식

참고: 조끼를 입고 면도한 가슴 외부에 대전극을 배치할 때 이 단계를 건너뛸 수 있습니다.

1. 설치류를 엎드린 상태(가슴에) 수술대에 놓습니다.
   참고: 흡입 마취의 경우 쥐의 주둥이를 마취 노즐에 넣고 이소플루란 농도를 1.5-2%로 더 낮춥니다.
면
2. 도한 두피를 소독제 스프레이나 소독제(예: 에탄올 70%)에 적신 면봉으로 소독하고 자연 건조시킵니다. 두 번 반복합니다.
3. 메스로 눈높이에서 중이 높이까지 한 줄로 피부를 자릅니다.
   참고: 이렇게 하면 이식된 흉부 전극에서 머리 꼭대기를 향해 연결 케이블을 터널링할 수 있으며 직류 자극(DCS) 전극 소켓 배치를 위해 원하는 절단이기도 합니다.
4. 쥐를 바로 누운 자세로 돌려 가슴이 노출되도록 합니다.
5. 1.2단계에서 설명한 대로 가슴 피부를 소독합니다.
6. 조직 겸자로 오른쪽 가슴의 외측 피부를 들어 올리고 오른쪽 겨드랑이에서 내측 약 0.5cm의 작은 가위로 단추 구멍을 자릅니다. 그런 다음 가위로 두개골 방향으로 시상면을 직선으로 자릅니다.
7. 왼쪽 주요 가슴 근육에서 피부를 외상 없이 분리하여 피하 주머니를 형성합니다. 작은 가위를 반복해서 열어라(또는 식염수에 적신 면봉으로).
8. 동물을 오른쪽으로 돌려 열린 머리 피부의 왼쪽 후두 모서리에서 목을 따라 케이블 경로를 터널링하여 항상성 겸자를 사용하여 표면 근막을 관통하여 가슴 주머니로 빠져나갑니다.
9. 항상성 겸자를 조심스럽게 열어 날카로운 와이어가 벗어나지 않도록 백금 전극에 부착된 전극 케이블의 끝을 잡습니다. 전극이 파우치에 들어갈 때까지 터널을 통해 케이블을 당기고 납땜 지점이 설치류의 왼쪽 뒷다리를 향하도록 합니다. 설치류를 다시 엎드린 자세로 돌립니다.
멸
10. 균 합성 편조, 비흡수성 봉합사로 백금 플레이트를 두 개의 반대쪽 모서리 구멍에서 가슴 근막에 고정합니다(안정성을 위해 4-5노트 권장).
11. 마찬가지로 느슨한 매듭으로 케이블을 근막에 연결하여 조직 터널 입구 앞에 약간의 고리를 형성합니다.
12. 상처 크기에 따라 3-4개의 피부 봉합사로 피부를 봉합합니다(전극과 케이블에 동일한 봉합사 재료를 사용할 수 있음).

2. 수술 절차: 두개외 경두개 전기 뇌 자극(tES) 소켓 배치

1. 동물을 정위 프레임에 배치합니다.
   참고: 흡입 마취를 사용하는 경우 마취제의 농도를 발가락 꼬집기 반사 및 호흡 패턴에 맞게 조정된 ~1.5-1%의 유지 이소플루란 유량으로 낮춥니다.
2. 1.2단계에서 설명한 대로 면도한 두피를 소독합니다.
3. 메스로 눈높이에서 중이 높이까지 한 줄로 피부를 자릅니다.
   참고: 흉부 전극 배치를 수행한 경우 2.2단계와 2.3단계가 이미 수행되었습니다.
골
4. 막(두개골의 결합 조직)을 메스로 옆으로 긁어내고 면봉으로 완전히 닦아냅니다. 상처의 4개 모서리에 결합 조직을 불독 클램프로 고정하고 옆으로 매달아 수술 영역을 열어 둡니다.
5. 0.9% 식염수를 바르고 면봉으로 뼈 표면과 조직을 청소합니다. 그런 다음 뼈 표면을 3% H₂O₂로 청소합니다. 티슈와의 접촉을 피하십시오. 이로써 뼈가 더 철저하게 청소되고 뼈에서 나오는 경미한 출혈이 멈출 것입니다. 또한 골막의 잔여물이 보입니다. 적당한 압력을 가하는 면봉으로 이러한 잔여물을 제거합니다.
   참고: 골막 잔여물을 제거하면 뼈에 접착된 tES 소켓의 접착력과 내구성이 증가합니다.
   출
   1. 혈이 멈출 수 없는 경우 뼈 드릴을 사용하여 뼈를 약간 눌러 1-3초 동안 만집니다. 이 기계적 절차는 대부분의 경우 상당한 가열 없이 출혈을 멈춥니다. 뼈에 전기 소작술을 사용하지 마십시오. 짧은 적용으로도 뇌 조직 손상이 발생할 수 있습니다(전기 소작술은 상처 조직 출혈에만 사용해야 함).
6. 고정 나사는 설정 접착력을 향상시키므로 나사 크기에 맞는 드릴 비트를 선택하십시오. 핸드 드릴로 미리 드릴링한 다음 뼈 드릴로 약간의 수직 압력을 가하여 두 개의 서로 다른 뼈 플레이트에 두 개의 버 구멍을 배치합니다. 전극을 조이는 데 방해가 될 수 있으므로 tES 소켓의 원하는 위치에 근접하지 마십시오(예: 왼쪽 일차 운동 피질 tES의 경우 오른쪽 정면 및 후방 두정엽 나사 위치를 선택).
7. 이식된 상대 전극의 경우 터널 케이블의 향후 고정을 위해 오른쪽 후두정엽 뼈에 위치한 세 번째 구멍을 버링합니다.
8. 플라스틱 나사를 버 구멍에 넣고 첫 번째 마찰이 느껴질 때까지 나사를 조입니다. 그런 다음 추가로 180° 나사 회전을 세 번 수행합니다. 겸자로 나사의 안정성을 확인하고 충분히 조이지 않으면 한 바퀴 더 추가합니다.
   참고: 성인 쥐의 경우 경막이나 뇌를 손상시키지 않고 나사를 경막외로 배치할 수 있습니다(나사산 설계에 따라 회전 횟수가 다를 수 있음). 신경변성 임계값을 초과하는 DCS 전류 밀도에서도 스테인리스 스틸 나사의 사용이 가능해야 합니다. 나사 배치는 나사 아래의 병변 위치나 범위를 교란하지 않았습니다.
9. 납땜 인두를 켜고 약 5분 동안 예열합니다. 조직 터널에서 나오는 케이블을 오른쪽 두정엽 나사 주위에 후두로 감은 다음 권선 뒤에 약 1cm의 케이블을 남겨두고 절단합니다. 메스로 케이블 끝의 절연체를 조심스럽게 벗겨냅니다.
10. 권선 케이블을 시아노아크릴 접착제로 나사와 뼈에 고정합니다.
11. 커넥터와 상대 전극 케이블의 나선에 소량의 무연 주석 용접재를 바르고 주석 용접재가 녹을 때까지 납땜 팁을 만지면서 미리 납땜된 두 부품을 짧게 눌러 둘 다 연결합니다(약 2-3초). 케이블의 과도한 금속 가열과 후속 조직 손상을 방지하기 위해 납땜 팁을 즉시 제거하십시오.
12. 구부러진 톱니 모양의 끝 집게로 맞춤형 tES 전극 소켓(그림 1B, 빨간색)을 집어 소켓의 하단 테두리에 시아노아크릴 접착제를 얇게 바릅니다. 운동 피질 위에 배치하고 직경 4mm의 소켓을 사용하려면 중간 소켓 지점을 브레그마에서 앞쪽 2mm, 측면 2mm에 배치합니다. 이 위치의 경우 소켓의 내부 내측 경계는 시상 봉합사에서 직접 끝나야 하고 꼬리 경계는 bregma 높이에서 끝나야 합니다. 소켓을 뼈에 짧게 누릅니다(대부분의 시아노아크릴 접착제는 압력에 의해 경화됩니다).
    알림: 소켓 바로 위에 광원을 배치하면 소켓을 더 쉽게 배치할 수 있습니다.
13. 소켓 영역 내의 뼈에 접착제가 없는지 확인하십시오(접착제가 반사되므로 빛으로 확인). 접착제가 엎질러진 경우 소켓을 제거하고 메스로 접착제를 긁어낸 후 2.12단계를 반복합니다.
14. 소켓이 제자리에 있고 미래의 자극 영역에 접착제가 없는 후, 먼저 소켓의 측면 경계를 시아노아크릴 접착제 한 방울로 인접 조직에 밀봉하여 이 위치에서 전류 션트로 이어질 수 있는 유체 브리지를 피합니다. 접착제가 자극 영역으로 흘러 들어갈 수 있으므로 너무 많이 바르지 마십시오(이 경우 2.12단계로 돌아가십시오).
    참고: 자극 영역을 줄이면 전류 밀도(A/m²)가 크게 증가할 수 있으므로 자극 영역에 접착제가 없는 상태로 유지하는 것이 중요합니다.
15. 모든 나사를 시아노아크릴 접착제로 덮습니다.
16. 작은 실리콘 튜브 또는 유리에 2액형 치과용 아크릴 시멘트를 혼합합니다. 점성이 생기면 치과용 주걱으로 발라서 소켓의 나머지 경계를 뼈에 밀봉합니다. 치과용 아크릴 시멘트가 자극 부위로 흐르지 않도록 하십시오.
17. 마지막으로 두개골 전체, 나사, 상대 전극 케이블 및 소켓의 최대 1/3까지 소켓을 치과용 아크릴 시멘트로 덮습니다. 시멘트의 점도가 올바른지 확인하십시오: 너무 유동적이면 주변 조직으로 흘러 들어갑니다. 너무 딱딱하면 고르게 분포하기 어렵습니다.
18. 모든 뼈가 덮이고 시멘트가 굳으면 불독 클램프를 제거하십시오. 피부는 봉합이 필요하지 않도록 쌓인 시멘트에 닿아야 합니다. (초기 절단이 너무 길게 선택되어 결합 조직이나 근육이 보이는 경우 1.12단계에 설명된 대로 봉합사를 적용합니다.)
19. 잘린 피부의 경계 주위에 면봉으로 요오드를 한 겹 바르고 카프로펜을 피하 주사합니다(통증 치료 및 수액 대체를 위해 5-7.5mL의 0.9% 식염수에 용해된 5mg/kg 체중).
    참고: 흡입 마취를 사용하는 경우 지금 끄십시오.
20. 설치류가 깨어나 자세 안정성이 회복될 때까지 마취에서 회복하기 위해 설치류를 온열 상자에 넣으십시오.
    참고: 기관의 권장 사항에 따라 동물의 체중 발달, 상처 상태 및 일반적인 건강 기준을 매일 확인하십시오.

3. 경두개 전기 자극 절차

참고: 마취는 tES 효과에 영향을 미치므로 가능할 때마다 경계하는 설치류에게 자극을 수행하는 것이 좋습니다. 실험을 시작하기 전에 설치류가 최소 5일 동안 회복되도록 하십시오(머리와 가슴 상처의 치유). 가슴 상처가 가장 짜증이 나기 때문에 조끼로 고정된 외부 대전극을 사용하는 경우 수술 후 이른 시점에 실험을 수행할 수 있지만 동물은 며칠 동안 전극 조끼에 익숙해져야 하며 행동 작업에 간섭이 발생할 수 있습니다.

1. tES 전극 소켓 절반을 0.9% 식염수로 채우고 기포를 제거합니다.
2. 음극 경두개 직류 자극(tDCS) 세션 전에 항상 염소 처리를 확인하고 필요한 경우(예: 반짝이는 은색 표면) Ag/AgCl 전극을 다시 염소화하십시오. 양극 tDCS 세션 전에 자극 중 좋은 전도성을 허용하기 위해 사포로 이전 자극에서 가능한 과도한 AgCl 침전물을 제거합니다. tES 전극 나사 캡을 조입니다(그림 1B, 회색 조각).
   주의: 음극 tDCS 세션 사이에 전극을 다시 염소화하지 않으면 자극 중에 염소화가 고갈되고 전기화학 반응에 의해 독성이 축적됩니다. 이것은 조직 손상을 유발합니다. 자극 시간이 20분 미만인 경우 단일 세션 내에서 재염소 처리가 필요하지 않습니다.
3. 케이블을 헤드의 두 커넥터에 연결합니다(양극 자극의 경우 양극 케이블은 나사 캡의 커넥터에 연결되고 음극 자극의 경우 그 반대입니다).
   참고: 외부에 배치된 상대 전극을 사용할 때는 상대 전극을 전도성 젤로 덮고 설치류의 가슴에 놓으십시오. 이것은 설치류가 자극하는 동안 착용할 수 있는 작은 설치류 조끼에 전극이 미리 고정되어 있는 경우 가장 쉽습니다.
4. 설치류를 실험용 케이지에 넣고 케이블을 케이지 위의 회전대에 연결하여 자유롭게 움직일 수 있도록 합니다.
5. 자극기를 켜고 자극 매개변수(자극 강도, 지속 시간, 램프 업 및 다운 시간)를 조정합니다.
6. 안전 종료 및 단선 경보가 있는 시중에서 판매되는 자극 장치를 사용하지 않을 때는 회로에 미터를 포함하여 정전류 흐름을 확인하십시오.
   알림: 이 설정을 사용하면 행동 작업을 수행하거나 훈련하는 동안 자극을 적용할 수 있습니다.
7. 자극을 받는 동안 설치류에게 스트레스나 불편함의 징후가 있는지 확인하십시오.
8. 자극이 끝나면 케이블을 분리하고 헤드의 전극 캡을 푼 다음 면봉으로 소켓을 청소하고 말립니다. 설치류를 가정 환경으로 돌려보내거나 원하는 경우 행동 절차를 진행하십시오.

그림 1: tES 소켓 및 전극 캡 장치의 수술 및 기술 체계를 위한 소모품. (가) 1. 면봉, 2. 소독제, 3. 정위 프레임, 4. 납땜 인두, 5. 진통제(예: 카프로펜), 6. & 7. 마취제(예: 자일라진 및 케타민), 8. 주사기, 9. 클리퍼, 10. 귀 펀처, 11. 눈 연고(예: 베판텐), 12. 무연 주석 땜납, 13. 2액형 치과용 아크릴 시멘트(DAC), 14. 요오드, 15. 3% H2O2, 16. 식염수 0.9%, 17. 합성 편조 비흡수성 봉합사(예: Mersilene 4-0), 18. 드릴 비트, 19. 시아노아크릴 접착제, 20. 불독 클램프 21. 항상성 겸자, 22. 구부러진 톱니 모양의 끝 겸자, 23. 곧고 날카로운 끝 집게, 24. 직선, 조직 겸자, 25. 치과 주걱, 26. 메스, 27. 가위, 28. 핸드 드릴, 29. 스크류 드라이버, 30. 모터 구동 드릴, 31. 암 커넥터, 32. tES 소켓, 33. 케이블에 부착된 정사각형 백금 전극, 히스토아크릴 접착제로 덮인 납땜 조인트, 34. 플라스틱 나사. (B) 내경 4mm의 설치류 두개골에 고정하기 위한 tES 소켓(빨간색); 전극 유닛(회색)은 스크류 캡과 스탬프 바닥에 접착된 Ag/Cl 디스크 전극의 케이블을 위한 공간을 남겨둔 중앙 구멍이 있는 내부 스탬프로 구성됩니다. 이를 통해 설정의 안정성을 극대화하고 민감한 전극 연결 지점에서 와이어 파손을 방지