주변 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)에서 γδ T 세포를 확장하는 방법을 설명합니다. PBMC - 파생 γδ T 세포는 자극과 zoledronate과 인터루킨 - 2 (IL - 2)를 사용 확장됩니다. γδ T 세포의 대규모 확장이 암의 autologous 세포 immunotherapy에 적용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
인간 γδ T 세포가 인식하고 스트레스 유발 항원의 다양한 반응, 따라서 본래 광범위한 안티 종양 및 안티 infective 활동을 개발하고 있습니다. 말초혈에서 γδ T 세포의 1 대부분 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체 있습니다. 이러한 세포의 주요 histocompatibility 복합 독립적인 방식으로 항원을 인식하고 강한 cytolytic과 Th1과 같은 이펙터 기능을 개발할 수 있습니다. 1 따라서, γδ T 세포가 암 immunotherapy에 대한 매력적인 후보 효과기 세포 수 있습니다. Vγ9Vδ2 T 세포 같은 phosphoantigens에 대응 (E) -4 - 히드록시 -3 - 메틸 -하지만 - 2 - enyl 나트륨 (HMBPP), isoprenoid 생합성 통해 박테리아에 합성하는, 생산 2 isopentenyl 나트륨 (IPP), mevalonate 경로 3. 생리적 조건을 통해 진핵 세포에서 nontransformed 셀에 IPP의 세대 γδ T 세포의 활성화를 위해 충분하지 않습니다. 종양 세포에서 mevalonate 경로의 Dysregulation는 IPP의 축적과 γδ T 세포의 활성화로 연결됩니다. 3 aminobisphosphonates (예 : pamidronate 또는 zoledronate 등) farnesyl 나트륨의 synthase (FPPS), mevalonate 경로에서 IPP의 하류를 연기 효소의 세포내 수준을 억제하기 때문에 IPP 및 γδ T 세포 인식에 sensitibity는 therapeutically aminobisphosphonates 증가 수 있습니다. IPP 축적 aminobisphosphonates와 γδ T 세포를 활성화하여 암 우리에게 immunotherapy 수 aminobisphosphonates의 pharmacologically 관련 농도와 종양 세포보다 nontransfomred 세포에 덜 효율적이다. PBMC는 aminobisphosphonates로 치료하는 경우 4 흥미롭게도, IPP 때문에 효율의 monocytes에 쌓입니다 이러한 세포로 약물 이해. IPP 항원 제시 세포되고 주변 혈액에 Vγ9Vδ2 T 세포를 자극 축적 5 Monocytes가 6. 이러한 메커니즘을 바탕으로, 우리는 zoledronate와 인터루킨를 사용하여 γδ T 세포 문화의 대규모 확장을위한 기술을 개발 -2 (IL - 2). γδ T 세포의 확장 7 다른 방법은 합성 phosphoantigens의 bromohydrin 나트륨 (BrHPP) 8 2 - 메틸 - 3 - butenyl - 1 - 나트륨 (2M3B1PP)를 활용 9. 이러한 방법 중 모든 전 수 입양 immunotherapy에 사용하기 위해 γδ T 세포의 다수의 결과로 생체내 확장. 단, zoledronate은 FDA의 승인을 상용 시약입니다. CD45RA - - Zoledronate - 확장 γδ T 세포는 CD27 표시 효과기 메모리 표현형과 그들의 기능은 IFN - γ 생산 분석 7 평가할 수 있습니다.
프로토콜
1. PBMC의 분리
- BD Vacutainer CPT 셀 준비 튜브 나트륨 헤파린과에 혈액 (7.5-8.0 ML)를 그립니다. 튜브는 나트륨 헤파린의 항응고제와 Ficoll - Hypaque 밀도 유체, 더하기 두 액체를 분리 폴리에스터 겔 장벽을 포함하고 있습니다. 1,800 X g에서 20 분 수평 로터 (스윙 아웃 헤드)에 실온 (18 ° C 25 ° C)에서 튜브 / 혈액 샘플을 원심 분리기. 브레이크를 원심 분리기 전환합니다.
- 원심 분리 후, 레이어의 순서 (위에서 아래에서 본) 다음과 같이 발생합니다 :) 플라즈마 - B) 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)과 혈소판 - C) 밀도 솔루션 - D) 폴리에스터 겔 - E) granulocytes - F) 적혈구 (그림 1).
- 셀 계층을 방해하지 않고 계면 위의 플라즈마의 5~10mm를 떠나, 플라즈마 층의 일부를 수집합니다. 플라즈마는 문화 (섹션 2.5)을 위해 사용될 수 있습니다.
- 15 ML 원뿔 관에 피펫 및 이전과 계면에서 농축 분율 (PBMC)를 수확.
- 10 ML과 PBMC을 씻 는다 인산염 버퍼 반전 튜브에 의해 생리 (PBS), 5 번, 그리고 400 X g에서<....
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토론
여기서 제시하는 방법은 PBMC에서 γδ T 세포의 효율적인 확장이 가능합니다. γδ T 세포가 활성화되고 확대 zoledronate로와 IL - 2는 시토킨 생산 및 세포 독성에 의해 반사 완료 효과기 기능을 개발할 수 있습니다. 그것은보고되었음을 합성 phosphoantigens의 bromohydrin 나트륨 (BrHPP) 및 2 - 메틸 - 3 - butenyl - 1 - 나트륨 (2M3B1PP)는 또한 γδ T 세포를 확장하고 있지만, 그들은 상업적으로 사용할 수 없습니다. 대조적으로, zoledronate 이미 Zometa으로 임상 응용에 대한 라이센스입니다. 따라서 신뢰할 수있는 시약을 쉽게 사용할 수 있습니다.
문화 미디어 및 혈청의 선택은 중요합니다. 이러한 ALyS203 (셀 과학 기술 연구소) 또는 성공 γδ T 세포 확장을위한 OpTmizer (Invitrogen)와 같은 적절한 문화 미디어를 사용합니다. 11 그 autologous.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 (옵션) |
| ZOMETA | 노바티스 제약 K. K | zoledronate | |
| PROLEUKIN | 노바티스 제약 | 인간 재조합 IL - 2 | |
| BD Vacutainer CPT 셀 준비 튜브 나트륨 헤파린과 함께 | BD | 362753 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| ALyS203 - 중간 | 셀 과학 기술 연구소 | 0301-7 | |
| OpTmizer | Invitrogen | 0080022SA | |
| brefeldin | 시그마 | B5936 - 200UL | |
| phorbol 12 - myristate 13 - 아세테이트 (PMA) | 시그마 | P1585 - 1MG | |
| ionomycin | 시그마 | 13909 - 1ML | |
| IntraPrep | 베크맨 쿨터 | A07803 | |
| 안티 - 인간 인 경우에는 3 번 CD - FITC 또는 PE/Cy5 | 베크맨 쿨터 | A07746 FITC A07749 PE/Cy5 | |
| 안티 - 인간 CD4 - ECD | 베크맨 쿨터 | 6,604,727 | |
| 안티 - 인간 CD8-PE/Cy5 | 베크맨 쿨터 | 6,607,011 | |
| 안티 - 인간 CD14-PE/Cy5 | 베크맨 쿨터 | A07765 | |
| 안티 - 인간 CD19 - PE | 베크맨 쿨터 | A07769 | |
| 안티 - 인간 CD45 - ECD | 베크맨 쿨터 | A07784 | |
| 안티 - 인간 CD56-PE/Cy5 | 베크맨 쿨터 | A07789 | |
| 안티 - 인간 TCRαβ - PE | 베크맨 쿨터 | A39499 | |
| 안티 인간 TCR - FITC Vγ9 | 베크맨 쿨터 | IM1463 | |
| 안티 - 인간 CD27-PE/Cy5 | 베크맨 쿨터 | 6,607,107 | |
| 안티 - 인간 CD45RA - ECD | 베크맨 쿨터 | IM2711 | |
| 안티 - 인간 CD69 - PE | BD | 555531 | |
| 안티 - 인간 NKG2D - PE | 베크맨 쿨터 | A08934 | |
| 안티 humal IFNγ - PE | 베크맨 쿨터 | IM2717U | |
| 마우스 IgG1 isotype 제어 PE | 베크맨 쿨터 | A07796 | |
| 마우스 IgG1 isotype 제어 ECD 또는 PE/Cy5 | 베크맨 쿨터 | A07797 A07798 |
참고문헌
- Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity. Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).
- Hintz, M. Identificati....
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