약물 주입 및 전기생리학 결합을 위한 미세유체 기반 미세 주입 시스템

초록

출처: Vanegas, M. I., et al. 약물 주입 및 전기생리학을 결합하기 위한 Microinjectrode 시스템. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 정확한 부피 추적을 위해 유성 마커 용액을 사용하고 신경 기록 및 약물 주입을 동시에 가능하게 하는 모세관을 통해 약물 용액을 전달하는 미세 전극 기반 미세유체 장치를 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 자극 및 기록을 위한 미세 주입 장치의 구성(그림 1a)

1. 캐뉼라와 프로브(이 예에서는 나노 센서)의 길이를 측정합니다. 프로브는 캐뉼라 팁에서 돌출되는 길이(프로브 설계에 따라 다름)만큼 캐뉼라보다 길어야 하며, 약 2cm를 더해야 합니다.
2. 돋보기 또는 현미경(~10배 배율)에서 프로브를 캐뉼라에 로드합니다. 가능하면 프로브 끝을 보호하기 위해 백로드가 바람직합니다.
   참고: 수동으로 수행되는 이 단계는 어렵습니다. 실제 실험 프로브를 시도하기 전에 돋보기 아래에서 미세 전극을 사용하여 연습하는 것이 좋습니다.
3. 캐뉼라(프로브 포함)를 상단 페룰, T-접합 및 하단 페룰을 통과시킵니다.
   프로
   1. 브가 어태치먼트가 없는 단일 와이어인 경우, 프로브를 캐뉼라에 백로드하고 어셈블리를 하단 페룰에서 T-접합에 삽입합니다. 캐뉼라의 상단(평평한 쪽)은 상단 페룰이 아닌 하단 내부의 T자 교차점 중앙에 위치해야 합니다. 실험용 프로브 또는 바이오 센서는 페룰 상단 위로 돌출되어야 합니다.
      알림: 맞춤형 페룰은 마이크로 드릴 비트를 사용하여 페룰 플러그에 구멍을 뚫어 만들 수도 있으며, 구멍의 크기는 캐뉼라를 T-접합부에 조이는 데 필요한 직경을 기준으로 합니다.
4. 페룰 렌치를 사용하여 T-접합의 상단과 하단에 있는 페룰을 조입니다. 과도하게 조이지 마십시오. 상단 페룰 내의 전극 지지대를 강화하기 위해 작은 튜브 조각을 추가할 수 있습니다.
5. 프로브의 사양에 따라 각 프로브 단자(신호, 접지 등)에 금 핀을 납땜합니다.
6. 프로브와 캐뉼라의 상대 위치를 조정합니다. 확대 시 프로브가 캐뉼라에서 돌출되는 거리를 측정하고 상단에서 수동으로 조정합니다(프로브는 페룰 내에서 자유롭게 미끄러질 수 있음).
7. 골드 핀과 상단 페룰 사이에 에폭시 접착제를 추가하여 프로브를 페룰에 부착합니다.
8. 상단 페룰의 나사를 풀어 캐뉼라 내부의 프로브를 집어넣습니다. 확대 시 프로브가 캐뉼라 내에 완전히 있는지 육안으로 확인합니다.
9. 인젝트로드를 마이크로드라이브에 부착합니다.

2. 약물 주입을 위한 미세 주입 시술의 구성(그림 1b)

1. 페룰을 사용하여 캐뉼라의 "비경사되지 않은" 또는 평평한 끝을 T-접합의 바닥에 부착합니다. 페룰 렌치를 사용하여 페룰을 조입니다.
2. 모세관 튜브의 작은 조각(~1.5cm)을 표준 페룰을 통과시켜 T-접합 상단에 부착합니다. 페룰 렌치로 조입니다.
3. 모세관, T-접합, 캐뉼라 및 해당 페룰을 통해 미세 전극을 백로드합니다.
4. 전극의 뒤쪽 끝이 모세관 뒷면에서 1cm 미만으로 돌출되고 전극 끝이 하단의 원하는 거리에서 캐뉼라에서 돌출되어 있는지 확인하십시오. 전극 위치는 상단에서 수동으로 조정할 수 있습니다.
5. 미세 전극 단자에 금 핀을 납치합니다.
6. 골드 핀과 상단 페룰 사이에 에폭시 접착제를 추가하여 미세 전극을 페룰에 부착합니다.
7. 상단 페룰의 나사를 풀어 캐뉼라 내부의 프로브를 집어넣습니다. 미세 전극이 캐뉼라 안으로 완전히 들어갔는지 육안으로 확인합니다.

3. 미세유체 회로의 구성(그림 2)

1. 브레드보드를 안정된 표면에 놓습니다. 두 개의 3방향 밸브를 브레드보드의 가장 긴 면과 평행하게 약 6인치에 놓습니다. 하나의 포트(항상 열려 있는 포트)가 서로 마주보고 있습니다. 나사를 사용하여 밸브를 브레드보드에 고정합니다.
2. 밸브 옆에 자를 놓습니다(모세관 튜브 내부의 유체 움직임을 측정하고 추적하기 위해).
3. 1:1 저점도 오일과 식용 색소(마커)의 혼합물을 기밀 주사기에 넣고 마커 펌프에 넣습니다. 모세관 튜브 한 조각을 절단하고 표준 페룰과 루어 잠금 커넥터를 사용하여 주사기를 입력 밸브의 포트 중 하나에 연결합니다. 이것이 "마커 라인"입니다.
4. "눈금자 선"을 위해 짧은 모세관 튜브를 자릅니다. 표준 페룰을 사용하여 밸브의 마주 보는 포트에 조입니다.
5. 두 개의 더 긴 모세관 튜브를 절단하여 출력 밸브를 마이크로인젝트로드에 연결하고 약물 펌프를 입력 밸브에 연결합니다(표준 페룰 사용).
   알림: 이 두 라인의 길이는 실험 설정에 따라 다르며, 하나는 주입 장치에서 동물까지 도달할 수 있을 만큼 충분히 길어야 하고 다른 하나는 약물 펌프에서 입력 밸브까지 도달할 수 있을 만큼 길어야 합니다. 절단석을 사용하여 모세관 튜브를 절단합니다.

4. 마이크로드라이브에 마이크로인젝로드 장착(그림 3)

1. 장착하기 전에 마이크로전극/실험 프로브가 캐뉼라에 들어갔는지 확인하십시오.
   참고: 가이드 튜브는 마이크로드라이브의 위치에 있어야 합니다.
2. 맞춤형 어댑터를 마이크로인젝트로드에 부착합니다.
3. 가이드 튜브를 통해 마이크로인젝로드를 상단 로드하고 나사를 사용하여 어댑터에 고정합니다.
4. 마이크로인젝트로드가 가이드 튜브에서 돌출된 마이크로드라이브 위치(깊이)를 측정한 다음 ~1cm 후퇴시켜 삽입을 준비합니다.
5. 미세 주입 실험의 경우 "뇌 라인"을 미세 전극의 사용하지 않는 T-접합 개구부에 연결합니다. 표준 페룰을 사용하고 페룰 렌치로 조입니다.

5. 미세유체 시스템의 세척 및 준비

1. 마이크로인젝트로드가 있는 마이크로드라이브를 폐기물 비커 위에 놓습니다.
2. 클로르헥시딘(예: 놀바산, 20g/L로 용해)을 1mL 기밀 주사기에 넣고 약물 펌프에 넣습니다. 유체가 약물 펌프에서 밸브를 통해 밸브 라인으로 이동하여 "브레인 라인"으로 나가도록 밸브의 흐름 방향을 돌립니다.
3. 최소 10분 동안 낮은 유속(50-200μL/min)을 사용하여 클로르헥시딘으로 회로를 세척합니다. 멸균 식염수와 공기로 5.2-5.3단계를 반복합니다.
   참고: 이 단계에서 누출을 확인하는 것이 중요합니다. 접합부에 보푸라기가 없는 물티슈를 부드럽게 발라 페룰을 통해 액체가 새는 것을 방지합니다.
4. 500μL 기밀 주사기에 약물을 넣고 공기를 압축한 다음 약물 펌프에 넣습니다. 마이크로인젝로드에서 몇 방울이 흘러나올 때까지 50μL/min으로 흐릅니다.
5. 가이드 튜브를 클로르헥시딘(20g/L로 용해)에 15분 동안 담가둡니다.
6. 출력 밸브의 방향을 "플러싱 라인"으로 돌립니다. 눈금자 선에 색상과 오일의 선명한 가장자리가 관찰될 때까지 마커 펌프를 전진시킵니다. 두 수용성 물질이 혼합되지 않고 그 사이의 날카로운 모서리를 잃지 않도록 약물과 색상 사이에 항상 오일이 있는지 확인하십시오. 이 오일/염료 라인의 시작 위치를 표시하십시오(테이프 또는 마커 사용).
7. 출력 밸브의 방향을 뇌 라인 쪽으로 돌립니다.

6. 기록 또는 주입 실험 수행

참고: 동물 취급 단계는 실험실 및 실험에 따라 다릅니다. 다음 단계는 경막을 노출시키기 위해 필요한 수술 설정 및 준비 후에 수행되어야 합니다. 실험 후 필요한 모든 시술 후 단계는 기관에서 승인된 프로토콜에 따라 수행되어야 합니다.

1. 마이크로드라이브를 기록실에 부착합니다. 경막을 관통하도록 가이드 튜브를 내립니다.
   알림: 피질 손상을 방지하기 위해 가이드 튜브는 경막보다 더 이상 관통해서는 안 됩니다.
2. 마이크로인젝로드를 뇌에 기록/주입하기 위해 부위 위 약 2mm로 내립니다.
3. 상단 페룰(돌출된 미세 전극/바이오 센서)을 조이고 금색 핀을 기록 시스템에 연결합니다. 마이크로인젝트로드를 표적 부위로 계속 전진시킵니다.
   참고: 계산에 미세전극이 캐뉼라를 넘어 확장되는 거리를 포함하는 것을 잊지 마십시오.
4. 주입 실험의 경우 수동 마이크로 시린지 펌프를 사용하여 오일 컬럼을 3분마다 1cm(~60nL/min)씩 이동합니다. 원하는 부피가 주입되면 출력 밸브를 플러싱 라인 쪽으로 전환합니다.
   참고: 주입되는 부피는 모델 종과 대상 뇌 영역에 따라 다릅니다. 더 빠른 유속은 신경 조직을 손상시킬 수 있습니다.
5. 실험이 완료되면 가이드 튜브 내에서 마이크로인젝트로드를 집어넣습니다(프로브를 돌출한 상태로 두십시오). 그런 다음 플러싱을 위해 마이크로드라이브를 제거합니다. 미세유체 시스템을 세척하여 재사용을 준비합니다. 메모: 우리의 경험에 따르면 마이크로인젝로드는 적절한 주의를 기울이면 여러 번 사용할 수 있습니다. 전기생리학적 기록 품질은 주사 능력보다 빠르게 떨어집니다.

결과

그림 1: 마이크로인젝로드의 단계별 제작.) 미세유체 시스템과 독립적으로 사용할 수 있는 구성. 캐뉼라와 프로브는 프로브의 끝이 원하는 길이(예: 150μm)로 돌출될 수 있는지 확인하기 위해 측정됩니다. 프로브는 캐뉼라에 전면으로 로드됩니다. 캐뉼라는 T-접합을 통과하여 하단에 부착되며 평평한 끝은 T-접합의 중앙에 있습니다. 프로브의 백엔드는 상단 페룰을 통해 계속됩니다. 마이크로인젝트로드는 각 ...

재료

https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3포트 수동 밸브 LabSmith		수동 3포트 선택 밸브(MV201-C360)	https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26
캐뉼라	Vita Needle Company	304 스테인레스 스틸 튜브, 외경 228μm, 내경 165μm	https://www.vitaneedle.com/assets/files/Vita_Needle_Master_Tubing_Gauge_Chart.pdf
절단석	Molex	절단석 1" x 1"(부품 번호 1068680064)	모세관 튜브를 절단하는 방법을 따르는 것이 좋습니다: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf
클로르헥시딘 디아세테이트	월마트	놀바산 용액 소독제(AAP311)	미세유체 회로 플러싱에 사용, 20g/L로 용해
어댑터	공급자	-	마이크로인젝트로드를 유압 마이크로드라이브에 연결하기 위한 맞춤형 가공 어댑터
		브레드보드 나사 설치용 LabSmith T7 TORX 드라이버(LS-TORX 드라이버)	https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25
에폭시 접착제	LabSmith	금속 및 플라스틱 접착용 2액형 고강도 에폭시 접착제(LS-EPOXY)	https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24
페룰	LabSmith	일체형 피팅(C360-100), 360μm OD 모세관	용 구멍 크기https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24
페룰 플러그	LabSmith	일체형 플러그(C360-101) 모든 -C360 포트	에서 사용https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24
일체형 피팅 및 플러그 설치용 페룰 렌치 LabSmith 1/8" 육각 렌치(LS-HEX 1/8" 육각 렌치)			https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24
기밀 주사기	Hamilton Company	500μL 기밀 주사기 모델 1750(81220) 및 1mL 기밀 주사기 모델 1001(81320)	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top
골드 핀	Aim-Cambridge	Male 금도금 압착식 커넥터 핀(40-9856M)	https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html
보푸라기 없는 물티슈	Kimberly Clark	Kimtech Science Kimwipes 섬세한 작업	시스템의 누출을 식별하는 데 사용되는 보푸라기 없는 물티슈
식용 색소	맥코믹 & 컴퍼니	수성 검정색 액체 식용 색소(52100581873)	https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color
저점도 오일	Clearco Products Co.	25°C에서 점도가 1cSt인 순수 실리콘 유체 옥타메틸트리실록산(PSF-1cSt)	http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html
루어락 커넥터	LabSmith	루어락 어댑터(C360-300), 루어락 주사기를 360μm 모세관 튜브	에 연결하기 위한 암 피팅https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24
마이크로 드릴 비트	Grainger	마이크로 드릴 비트, 0.23mm(414H85)	https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits
미세 전극	FHC	금속 미세 전극, 에폭시 절연	텅스텐https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes
오일 유압 마이크로 매니퓰레이터	Narishige Group	가이드 튜브 부착 오일 유압 마이크로 매니퓰레이터 (MO-96)	http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html
Polymicro 모세관 Molex		Polymicro 플렉시블 용융 실리카 모세관 튜빙 (TSP150375), 외경 375μm, 내경 150μm	https://www.molex.com/webdocs/datasheets/pdf/en-us/1068150024_CAPILLARY_TUBING.pdf
프로그래밍 가능한 주사기 펌프	Harvard Apparatus	표준 주입/인출 펌프, 프로그래밍 가능(70-2213)	https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html
Ruler	Empire	스테인리스 스틸 6" 뻣뻣한 눈금자(27303)	http://www.empirelevel.com/rulers.php
나사 세트	LabSmith	밸브 장착 나사 세트(LS-SCREWS .25), 밸브를 브레드보드에 장착하기 위한 나사 형성 나사(2-28 x 1/4")	https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24
표준 브레드보드	LabSmith	4" x 6" 플랫폼(LS600), 유체 회로 장착을 위한 0.25" 구멍 간격<
%.	Baxter	0.9% 염화나트륨 멸균	균 정맥 주입
멸균 주사기 필터	Millipore Sigma	MilliporeSigma™ Millex-GP™ PES 멤브레인이 있는 멸균 주사기 필터(SLGPM33RS)	https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs
Stoelting 수동 마이크로 주사기 펌프	Stoelting Company	수동 주입/인출 펌프(51222)	https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html
T-junction	LabSmith	360μm OD 모세관 튜브와 함께 사용하기 위한 흐름 스트림 결합용 상호 연결 티(C360-203)

맞춤형 맞춤형 드라이버 모세관 연결용 액체 a href='https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24'>https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24 멸균 식염수(염화나트륨) 0.9 멸