유도만능줄기세포 유래 인간 미세아교세포를 마우스 뇌로 경비강 이식

초록

출처: Parajuli, B., et.al. 비침습적 경비강 경로를 통한 면역 적격 마우스 뇌에 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 미세아교세포의 이식. J. Vis. 경험. (2022).

이 비디오는 유도 만능 줄기 세포 유래 인간 미세아교세포(iPSMG) 세포를 마우스 뇌로 경비강 이식하는 방법을 보여줍니다. 히알루로니다아제는 미세아교세포가 고갈된 마우스의 콧구멍에 적용되어 투과성을 향상시킵니다. iPSMG 현탁액을 비강 내로 투여하고 마우스를 회복시킵니다. 성장 인자가 풍부한 배지는 뇌 조직에서 iPSMG 생존을 지원하기 위해 정기적으로 투여됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 세포 배지, 이식 배지 및 마취 혼합물의 준비

1. Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM)에 10% 소태아 혈청과 0.1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하여 세포 배지를 준비합니다.
2. 인간 콜로니 자극 인자 1 또는 hCSF1(250ng/mL) 및 인간 형질전환 성장 인자 베타 1 또는 hTGF-β1(100ng/mL)을 세포 배지에 첨가하여 이식 배지를 준비합니다.
생
3. 리 식염수 11.8mL에 메데토미딘 염산염 0.45mL, 미다졸람 1.2mL, 타르타르산부토르파놀 1.5mL를 혼합하여 복강내 주사용 마취 혼합물을 준비합니다.

2. 유도만능줄기세포 유래 인간미세아교세포(iPSMG) 세포의 제조

참고: 냉동 iPSMG(Table of Materials)는 사용할 때까지 -80°C에서 보관하였다.

1. 37°C 수조에서 냉동 세포를 빠르게 해동합니다. 눈에 보이는 모든 얼음이 녹을 때까지 샘플을 소용돌이칩니다.
2. 해동된 유도만능줄기세포 유래 인간 미세아교세포(iPSMG)를 37°C로 예열한 배양 배지에 첨가합니다. 배지(10⁶ 세포 1× 1)를 함유한 해동 세포 1mL를 배양 배지 10mL에 첨가합니다.
3. 세포를 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 얻습니다.
4. 원심분리 후 세포 펠릿을 방해하지 않고 모든 상청액을 제거합니다. 이식 배지에서 사이토카인 농도의 희석을 줄이기 위해서는 상청액의 완전한 제거가 바람직합니다.
5. 이식 배지를 첨가하여 1 x 10⁵ 세포/μL의 세포 농도를 얻습니다.
6. iPSMG를 얼음 위에 놓고 즉시 이식을 진행합니다.
   참고: 이식을 위한 iPSMG의 준비는 오염을 피하기 위해 클린 벤치에서 수행됩니다.

3. 경비강 이식을 위한 마우스의 준비(Tsn)야

1. 생형 수컷 마우스(C57BL/6J, 8주령)에게 7일 동안 PLX5622 함유 식단을 먹인다.
2. 7^일째가 끝나면 PLX 식단을 중단하고 연구가 끝날 때까지 생쥐에게 정상적인 식단을 먹입니다.
   참고: PLX5622 함유 식단은 AIN-93G 1kg에 PLX5622 1.2g을 첨가하여 제조됩니다(재료 표).

4.

1. PLX 수료 중단 후 24시간 후에 세포의 경비강 이식, 마우스의 무게를 측정하고 마취 혼합물(0.2mL/20g)의 복강내 주사를 사용하여 마취합니다.
2. 페달 철회 반사(단단한 발가락 꼬집음)에 대한 무반응으로 평가한 대로 마우스를 완전히 마취한 후, 1시간 전에 인산염 완충 식염수(PBS)(100U/mL)에 2.5μL의 히알루로니다제를 투여
합니다.
3. 히알루로니다제를 도포한 후 마우스를 바로 누운 자세로 눕힙니다.
4. iPSMG의 경비강 이식 10분 전에 4.2단계를 반복합니다.
5. 10μL 피펫 팁을 사용하여 마우스의 한쪽 콧구멍에 2.5μL의 세포 현탁액을 도포합니다.
6. 세포 현탁액을 다른 쪽 콧구멍에 투여하기 전에 마우스를 5분 동안 누운 자세로 놓습니다.
7. 4.5단계와 4.6단계를 4회 반복하여 동물당 총 부피 20μL를 도포합니다.
8. 마취에서 회복될 때까지 마우스를 37°C 열 패드 위에 누운 자세로 놓습니다.
9. PLX 수료 중단 후 48시간 후에, 동일한 마우스에 대해 4.1-4.7단계를 다시 한 번 반복합니다.
   참고: 이식 중에 iPSMG 세포를 얼음 위에 놓는다는 점에 유의해야 합니다.

5. 사이토카인의 적용

1. 마취 혼합물(0.2mL/20g)의 복강내 주사에 의해 마우스를 마취합니다.
2. 10μL 피펫 팁을 사용하여 2.5μL의 이식 배지를 마우스의 한쪽 콧구멍에 도포합니다.
다른
3. 쪽 콧구멍에 이식 배지를 투여하기 전에 마우스를 5분 동안 누운 자세로 놓습니다.
4. 5.2단계와 5.3단계를 4회 반복하여 동물당 총 부피 20μL를 적용합니다.
   참고: 이식된 iPSMG의 생존력을 위해 이식 배지(인간 사이토카인)의 경비강 투여는 연구가 끝날 때까지 12시간마다 필요하다는 점에 유의해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)	Thermo Fisher Scientific	10566
AIN 93G	Oriental Yeast Co
소 태아 혈청	GE Healthcare Life Sciences	SH30070.03
냉동 iPSMG	시오노기 &., 주식회사		약 발견 및 질병 연구 연구소
인간 콜로니 자극 인자 1(hCSF1)	PeproTech	300-25
히알루로니다제	Sigma-Aldrich	H-3506
메데토미딘 염산	메이지 세이카	VETLI5
미다졸람	아스텔라스	18005A2
파라포름알데히드	와코 순수 화학 산업	162-16065
페니실린/스트렙토마이신	써모 피셔 사이언티픽	15140-122
피펫	에펜도르프	3120000011
펫 팁	에펜도르프	30076028
PLX5622	Amadis Chemical	A930097
형질전환 성장 인자-β1(Tgf-b1)	PeproTech	100-21

신염 피