방법 논문

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

DOI:

10.3791/3275

⸱

2011년 9월 13일

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

그대로 고립 Langendorff에 transmembrane 잠재력 (VM)과 일시적인 세포 내 칼슘 (CAT)의 광학 매핑하는 동안이 종이 자세히 해부 절차를, 수단 설치, 그리고 실험 조건 마우스 마음을 perfused.

초록

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마우스 마음이 수종의 유전 공학을위한 저비용 기술의 존재로 인해 심혈관 연구 인기있는 모델입니다. 마우스 심장의 심장 혈관 생리 phenotyping 쉽게 transmembrane 잠재력에 대한 다양한 프로브 (V M), 칼슘 과도 (CAT), 및 기타 매개 변수를 고용하는 형광 이미징을 사용하여 수행할 수 있습니다. 여기 - 수축 결합은 행동 잠재력과 세포 내 칼슘 역학의 특징이므로, 심장 1-4에서 같은 위치에서 동시에 V m 고양이 모두를지도에 매우 중요하다. Langendorff에서 동시 광학 매핑은 마우스 마음은 심장 마비, arrhythmias, 대사 질환 및 기타 심장 질환을 기본 메커니즘을 명료하게하다 수있는 잠재력이있다 perfused. 정품 인증을 시각화는 전도 속도, 작업 잠재 기간, 그리고 사이트의 수많은에 다른 매개 변수는 세포 수준 조사에서 얻을 수없는뿐만 광학 매핑 1,5,6에 의해 해결되었다. 본 논문에서 우리는 사용하는 최첨단 CMOS 이미징 기술.을 높은 spatio - 시간적 해상도 마우스 마음에 V m와 고양이의 동시 광학 매핑에 대한 계측 설치 및 실험 조건을 제시 이 방법으로 얻은 일관된 광학 녹음 Langendorff perfused 마우스 마음의 동시 광학 매핑이 가능하고 신뢰할 수있는 모두이다 보여줍니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 재고 솔루션의 고급 준비

  1. 탈이온수 사전에 Tyrode의 솔루션 (16X)의 두 재고 솔루션을 준비하고 4 저장할 ° C :
    1. 증권 I (119.872 g / L NaCl, 3.056 g / L CaCl 2 (2 시간 2 O), 5.6 g / L KCl, 2.6274 g / L 아니 2 PO 4 3.408 g / L MgCl 2 (6H 2 O), (피셔 과학, 공정한 잔디, NJ));
    2. 주식 II (26.88 g / L NaHCO3 (피셔 과학, 공정한 잔디, NJ)).
  2. 형광 염료의 재고 솔루션을 준비합니다. 반복 동결 융해를 방지하기 위해, 우리는 -20 ° C, 한 실험에서 충분 두 염료의 30 μl aliquots를 저장할 :
    1. 전압에 민감한 염료 RH237 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 주식 솔루션, 디메틸 sulfoxide에서 1.25 MG / ML 솔루션 (DMSO, 시그마, 세인트 루이스, MO);
    2. 칼슘 표시기로드 - 오전 2시 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 주식 솔루션, DMSO 1 MG / ML 솔루션입니다.
  3. 사전에 (Bioscience Tocris, 세인트 루이스, MO, DMSO 2 MG / ML 솔루션) 여기 - 수축 uncoupler의 blebbistatin 주식 솔루션을 준비하고 4 해산 blebbistatin를 저장 ° C.

2. 재관류 솔루션 및 실험 설정 7 준비

  1. 갓 (128.2mM NaCl, 1.3mM CaCl 2 (2 시간 2 O), 4.7mM KCl, 1.05mM MgCl 2 (6H 2 O), 1.19mM 아니 2 PO 4, 20mM NaHCO 3 11.1mM D - 포도당 2L Tyrode의 솔루션을 준비 탈이온수, 산도에 = 7.35 ± 0.05). 주식 솔루션은 Tyrode의 솔루션 (하나의 실험을위한 충분한) 주식 I, II 증권 125 ML 125 ML에 탈이온수 및 믹스의 1750 ML를하고, 포도당의 4g의 2L하기 위해 사용되는 경우.
  2. 재관류 시스템의 두 펌프를 켭니다. 40 ML / 분 역행 재관류에 사용되는 연동 펌프 (사망 시에 스타, WPI, 사라소타, 미국)으로 설정합니다. superfusion에 사용되는 다른 연동 펌프 (콜 - Parmer Masterflex Peristalic 펌프 L / S, 콜 - Parmer 악기 회사, 버논 힐스, 일리노 이주) 설정 80 ML / 분 들고 저수지로 다시 perfusate을 반환합니다.
  3. 2L 탈이온수과 함께 다음 30 분 및 70 %의 에탄올과 재관류 시스템을 씻으십시오.
  4. 일단 모든 탈이온수은 Tyrode의 솔루션을 배포하고 5 μm의 필터 (Millipore, Billerica, MA, 미국)를 통해 통과, 챔버에서 철수합니다. 37에 perfusate을 따뜻하게 ° 솔루션으로 O 2 / CO 2 (95 % / 5 %) 가스를 품어하여 물 재킷 및 유통자 (ThermoNESLAB EX7, 뉴타운, 미국)와 산소 perfusate와 C. 산도 측정기 (Oakton 인 스트 루먼트, 버논 힐스, IL)과 솔루션의 산도를 모니터링하고 7.35 ± 0.05에서 산도를 유지하기 위해 O 2 / CO 2 버블링의 속도를 조정합니다. 실험 기간 동안 모니터링 산도와 온도를 계속합니다.
  5. 듀얼 광학 매핑 장치는 높은 공간 (100x100 픽셀, 230 ± 픽셀 당 20 μm의)과 측두엽 (1,000-3,000 프레임 / 초) 해상도를 두 MiCAM 울티마 - L CMOS 카메라 (SciMedia, 코스타 메사, CA)로 구성되어 있습니다. 지정된 칼슘 이미징 카메라 앞에 대역 통과 필터 (590 ± 15 nm의, Thorlabs, 뉴턴, NJ) 수정, 동안, 긴 패스 필터 (> 700 nm의, Thorlabs, 뉴턴, NJ)에 위치해야합니다 지정된 전압 이미징 카메라 앞에. 카메라 이색성 거울 (635 나노미터 컷오프, 오메가 광학, Brattleboro, VT)를 포함하는 보유자에 의해 서로 수직 정렬됩니다. 즉시 듀얼 카메라 홀더 아래 이색성 거울에 심장에서 나오는 방출 빛을 초점 렌즈 (니콘 NIKKOR 55mm 1:1.4 235,052)이 있습니다. 작동 거리는 약 3cm이다.
    여기 조명은 할로겐 램프 (뉴 포트 출창 인 스트 루먼트, 스트 랫 포드, CT, SciMedia, 코스타 메사, CA)에 의해 생성되며 열 필터, 셔터, 그리고 대역 통과 필터 (520 ± 45 nm의)를 통해 전달됩니다. 유연한 라이트 가이드는 준비에 대역 통과 필터 조명을 지휘하고, 셔터는 준비가 염료의 photobleaching 피하기 위해 이미지를 수집하는 동안에만 빛에 노출되도록하는 데 사용됩니다.
  6. 사전에 서성 거려 및 감지에 대한 자세 / AgCl이 전극을 준비하고 전에 마음을 배치하는 챔버에서 그들을 설치합니다. 앰프 및 필터가 적절한 수준으로 조정되었는지 확인합니다.

3. , 마우스 마음을 수확 cannulate하고, Langendorff 재관류를 설정

  1. 그리고 intraperitoneal 주사로 헤파린 (100 대), 마취제 / xylazine (xylazine, 10 MG / kg bodyweight ketamin, bodyweight를 80mg/kg)으로 마우스를 마취. 통증 반응의 부족으로 마취의 적절한 수준을 약속드립니다.
  2. 중간 흉골 절개 후, 신속하게 마음을 제거하고 (95% O 2 5 % CO 2) 산소에 씻어, 일정한 온도 (37 ± 1 ° C) Tyrode의 솔루션입니다.
  3. 해부 현미경을 사용하여, 빠르게 대동맥를 파악하고 올바른 쇄골하 동맥 아래의 상승 대동맥에 걸쳐 깨끗한 절단합니다. 대동맥의 짧은 부분이 다음 사용자 지정에 연결된 것은 flared 팁 21 - 게이지 정맥했다. 4-0 검은 꼰 실크 봉합사는 (외과 특산품 주식 회사, 읽기, PA) 정맥에 심장 문제를 해결하는 데 사용됩니다. cannulation 후, 마음 retrogradely perfused하고 Tyrode의 솔루션을 superfused. 브리지 앰프 TBM4M, WPI, 사라소타; 역행 재관류 율이 대동맥 압력 60 사이에 80 mmHg를 (압력 변환기, 세계 정밀 계기 Inc의 (WPI), 사라소타, 미국 유지 2-5 ML / 분 범위에서 조정됩니다 미국).
  4. 심장이 cannulated 후, 폐, thymus, 그리고 지방 조직은 다음 해부 및 제거됩니다.
  5. 분리된 마음은 스트림 유도된 운동을 방지하기 위해 재관류 챔버 하단 꼭대기 (Sylgard의 코팅)에서 (파인 과학 도구) 박혀있다. 오른쪽과 왼쪽 심방 appendages도 늘어과 심방의 광학적 측정 최대한의 면적을 제공하는 챔버의 바닥에 (파인 과학 도구, Inc의 포스터 시티, CA) 고정된 있습니다.
    매우 중요하다! 작은 실리콘 튜브가 폐동맥 혈관을 통해 좌심실에 삽입하고 인근 결합 조직에 실크 봉합사로 고정됩니다. 이것은 (파트 4 단계 19 참조) 여기 - 수축과 심실 uncoupler의 수축이 억제 후 특히 중요합니다 좌심실에 갇힌 perfusate의 솔루션 정체 및 산성화 방지합니다.
  6. 사용자 정의 만든 전극 마스터 8 (AMP 인 스트 루먼트 (주), 예루살렘, 이스라엘) 또는 PowerLab 26T (AD 인 스트 루먼트, 시드니, 호주)에 의해 생성된 서성 거려 stimulations를 수행하기 위해 심장의 표면에 배치됩니다.
  7. 작은 커버 유리가 진동 솔루션에서 모션 유물을 줄이기 위해 심장을 통해 솔루션의 표면에 고정됩니다.
  8. 마음에 여기 빛을 집중. 또한, 듀얼 카메라 장치와 최대 해상도를 얻을 수 있도록 마음 사이의 거리를 조정합니다.
  9. 객실의 모든 조명을 끄고 PowerLab 26T를 사용하여 전기 녹음을 시작.

4. 부하 전압과 칼슘에 민감한 염료 및 여기 - 수축 uncoupler

  1. blebbistatin의 따뜻한 - 최대 0.6 ML. 개최 저수지에서 perfusate와 blebbistatin 0.5 ML를 섞습니다. Tyrode의 솔루션 1 ML에 blebbistatin의 나머지 0.1 ML를 희석하여 천천히 정맥 부근 마약 포트를 통해 (20 분 동안)을 주사. blebbistatin이 점차 모션 유물을 줄여으로 관찰.
  2. 1 ML Tyrode의 솔루션에서 전압에 민감한 염료 RH237 재고 솔루션을 30 μL를 희석하여 천천히 blebbistatin 같은 사출 포트에 5-7분 이상 주입.
  3. 30 μL 칼슘 표시기로드 - 오전 2시 1 ML Tyrode의 용액에 희석하여 천천히 주사 같은 포트를 통해 50-10 분 이상 적용 후 Pluronic F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, DMSO의 20 % 용액)과 혼합하여 1시 1분입니다 .
  4. blebbistatin과 세포막과 cytosol에 도달하는 염료에 대한 5-10분 나올 때까지 기다리는 것이 좋습니다. 모션은 완전 제거되는 프로토콜로 계속 진행합니다.
  5. 지속적으로 모든 절차를 통해 모니터 ECG 녹음은 심장의 정상적인 전기 기능을 보장합니다.
  6. SciMedia 맞춤 소프트웨어 (SciMedia, 코스타 메사, CA)를 사용하여 형광 신호 기록 하십시요.

5. 대표 결과 :

figure-protocol-1
그림 1. 재관류, 전기 녹음 및 광학 매핑을위한 실험 설정.
EM은 = 방출, LP = longpass

figure-protocol-2
그림 2. 심실 서성 거려 동안 기록된 실험 준비 및 신호 예제. 왼쪽 : ECG 신호 자세 / AgCl이 디스크 전극 (상단)과 S1S1 자극 프로토콜의 예입니다 (아래)에서 표시됩니다 수집하고 있습니다. 센터 : Langendorff 마우스 심장 준비. 오른쪽 : 대표 광학 작업 잠재력과 심방 (위)과 심실 (아래)에서 칼슘을 과도 신호가 표시됩니다. 노란색 화살표 (위) 심방 기록에서 볼 수있는 심실에서 오는 형광 신호를 산란을 가리 킵니다.
LV = 좌심실; RV = 우심실; LA = 좌심방, RA = 바로 안뜰

figure-protocol-3
그림 3. V m과 야생 타입 마우스 심장의 심실에서 고양이의 대표 광학 녹음. 그의 광학 녹음 (C)에서 볼 수있는 검은 점들로 표시되어 균등하게 게재 위치의 배열과 대답 실험 준비. B. 예제 (상자가 나타 배열의 중앙 위치에서 V m과 고양이의 추적 IN (C)). 균등하게 게재 위치의 배열에서 C. V m (파란색) 및 CAT (빨간색). 신호는 3x3 binned되었습니다.

figure-protocol-4
그림 4. 활성화지도와 전도. 가로 (T)과 흰색 화살표로 표시 길이 (L) 방향과 야생 타입 마우스 마음에서 A. 예 활성화지도. B. V m 신호 (위) 및 본 세 지점 DV / DT (아래)에 해당 (T1, T2, T3, L1, L2, L3).

figure-protocol-5
그림 5. 액션 잠재력과 칼슘 과도 기간 분석. 80 % 휴식 (CaD80)에서 80 % repolarization (APD80)와 칼슘을 과도 기간에 A. 액션 잠재 기간이지도는 제어 조건 하에서 심장 (왼쪽)에서 30 나노미터 이소 프로 테레 놀 응용 프로그램 (오른쪽) 이후에 표시됩니다. 심실의 황색 / 녹색 색상 (오른쪽) 이소 프로 테레 놀은 APD80 및 CaD80을 단축 나타냅니다. 야생 타입 마우스 심실 (상단)과 심방 (아래)에서 APD80 및 CaD80의 B. 예제 tracings.

토론

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이 실험에서 우리는 여기 - 수축과 심실 uncoupler의 수축이 억제 후 특히 중요합니다 작은 실리콘 튜브를 추가하여 Langendorff 재관류 방법을 수정했습니다. 실리콘 튜브는 솔루션 정체, 재관류 솔루션의 산성화 및 좌심실의 국소 빈혈의 개발을 방지하는 데 사용됩니다. 마우스 마음이 저체온증에 매우 민감합니다, 따라서 심장에 걸쳐 온도 변화는 행동 잠재력의 기간이에서 인공 차이가 발생할 수 있습니다. 따라서 난방 시스템은 실험 8 전체 기간 동안 37 ° C의 일정한 온도를 유지하기 위해 재관류 챔버에서 구현되었습니다. Langendorff 모델은 마음의 innervation을 유지하지 않기 때문에, 하나는 생리 동정심과 parasympathetic 톤 9 조사하기 위해 perfusate에 신경 전달 물질을 추가하는 것을 고려해야합니다. 역행 재관류 외에, 마음의 superfusion의 추가는 산도와 온도 등 적절한 환경 변수를 유지하는 데 도움이됩니다. 이 방법에서는 Langendorff perfused 마음이 수평으로 배치되었다. 수직 Langendorff 재관류 설정은 10도 사용할 수 있지만 약간 다른 심장 역학 11 발생할 수 있습니다. CMOS 카메라뿐만 아니라, 다른 메이커도 사용할 수 있으며,지도 V m 동시에 CAT 12 적용할 수 있습니다.

높은 spatio - 시간적 해상도의 CMOS 카메라 응용 프로그램은 레코딩의 정확성을 보장하지만, 광학 매핑 신호는 단일 세포에서되지 않습니다. 오히려 각각의 형광 신호가 광학 배율에 따라 세포의 수백 또는 수천에서 비롯됩니다. 더 큰 심실 형광 광 산란에 의해 심방 신호를 왜곡 수 있으므로 광학적으로 기록된 신호의 해석주의가 필요합니다. 마우스 준비의 또 다른 제한은 심장 13 작은 크기로 인해 표면의 곡률에 의해 유도된 신호 왜곡과 소음이다. 전도 속도 측정은뿐만 아니라 마우스 심장의 곡률에서뿐만 아니라 전극 극성과 가상 전극에서 변경할 수 있습니다. 전도 속도, 활성화 이방성 및 repolarization지도의 정확도를 달성하기 위해, 마음의 표면에 카메라의 초점을 수정하는 것은 필수적입니다.

이 방법에서는 실시간 ECG 녹음은 심장 전기 생리학의 광 조사를 보완할 수 있습니다. 전압에 민감한 염료 (RH237)과 칼슘 표시기 (로드 - 오전 2시)이 있기 때문에 자신의 빠른 응답 프로토콜 유사한 여기, 독특한 발광 스펙트럼 3,7에 사용됩니다. V m 고양이 RH237 이외 및로드 - 오전 2시 3 측정하는 데 사용할 수있는 염료의 다른 조합이 가능합니다. 대형 스토 크의 시프트 (> 200nm)와 소설 전압에 민감한 염료, PGHI이 때문에 PGHI 및로드 - 오전 2시 14 층 사이의 방출 파장의 높은 분리의 더 나은 V의 m 고양이의 신호를 허용 발견되었습니다. 향후 개선 소설 형광 프로브, 새로운 영상 감지기의 개발, 향상된 이미지 처리 소프트웨어를 탐구에 초점을 수 있습니다. 높은 해상도와 3D 광학 매핑을위한 새로운 광학 이미징 modalities 또한 광학 매핑 5 중요한 미래의 방향입니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIH는 R01 HL085369을 부여합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
화학 회사 카탈로그 번호
NaCl 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ S271 - 1
CaCl 2 (2 시간 2 O) 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ C79 - 500
KCl 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ S217 - 500
MgCl 2 (6H 2 O) 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ M33 - 500
아니 2 PO 4 (H 2 O) 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ S369 - 500
NaHCO 3 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ S233 - 3
D - 포도당 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ D16 - 1
Blebbistatin Bioscience Tocris, Ellisville, MO 1760
RH237 Invitrogen, Carlsbad, CA S1109
로드 - 오전 2시 Invitrogen, Carlsbad, CA R1244
Pluronic F127 Invitrogen, Carlsbad, CA P3000MP
디메틸 sulphoxide (DMSO) 시그마, 세인트 루이스, MO D2650

참고문헌

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