Oligonucleotide - 결합 형광등 Microspheres를 사용하여 복잡한 임상 및 환경 샘플에서 박테리아의 멀티 플렉스 감지

Tim J. Dumonceaux; Jennifer R. Town; Janet E. Hill; Bonnie L. Chaban; Sean M. Hemmingsen

doi:10.3791/3344

Method Article

Oligonucleotide - 결합 형광등 Microspheres를 사용하여 복잡한 임상 및 환경 샘플에서 박테리아의 멀티 플렉스 감지

DOI:

10.3791/3344

⸱

October 23rd, 2011

Tim J. Dumonceaux¹ , Jennifer R. Town¹ , Janet E. Hill² , Bonnie L. Chaban² , Sean M. Hemmingsen³

¹Saskatoon Research Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, ²Department of Veterinary Microbiology, University of Saskatchewan , ³Plant Biotechnology Institute, National Research Council of Canada

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 oligonucleotide 결합 형광 구슬을 사용하여 샘플 내에 미생물의 검출을위한 다양한 방법을 설명합니다. 샘플 내의 모든 생물에서 Amplicon는 프로브 결합 구슬의 패널에 hybridized입니다. Luminex 또는 바이오 플렉스 악기는 비드 타입과 하이브 리다이 제이션 신호를 각 비드를 쿼리하는 데 사용됩니다.

Abstract

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세균성 vaginosis (BV)는 Gardnerella vaginalis에, Atopobium vaginae 포함한 세균 종의 숫자에 의해 지배 microbiota에 락토 - 지배와 다른 ^1-3에서 "정상적인"microbiota에 변화가 특징입니다 되풀이 polymicrobial 증후군이다. 이 조건은 HIV 취득 ^사를 포함하여 부정적인 건강 결과의 범위와 관련된이며, 그것은 임상 ^오 관리하기 어려울 수 있습니다. 또한, BV의 진단은 다양한 수치 기준 ^6,7에 대한 채점 아르 질 면봉 얼룩의 그램 얼룩의 사용에 의존하고 있습니다. 이 진단은 간단하고 저렴하고, 자원 제한 설정에 잘 적합하지만, 그것은 주관적인 해석에 관련된하고 질 microbiota ⁸ 구성에 대한 자세한 프로파일을 제공하지 않는 문제를 고생하실 수 있습니다. 최근 깊은 순서 노력과 함께 풍부하고 다양한 질 microbiota 감을 잡을수있다BV ^11,12의 분자 진단에 대한 잠재적인 공격 대상 숫자의 식별 결과가 정상 ^9,10 간주됩니다 그 개인에 비해 BV 진단 아르 개인에서 가져온 샘플 사이의 명확한 차이. 이러한 연구는 유용한 정보의 부를 제공하지만, 깊은 시퀀싱 아직 임상 설정에서 진단 방법으로 실용적되지 않습니다. 우리는 최근 빠르게 Luminex 플랫폼 ¹³ 감지 oligonucleotide - 결합 형광 구슬을 사용하여 멀티 플렉스 형식으로 질 microbiota를 프로 파일링하는 방법을 설명합니다. 이 방법은, 현재 그램 얼룩 기반의 방법처럼 신속하고 간단하지만 프로브 디자인 연구 순서에서 발생하는 분자 지식을 악용의 추가 이점을 추가합니다. 이 방법은 따라서 높은 특이성과 민감도 광고와 BV를 진단하는 데 사용할 수있는 질 면봉에 존재하는 주요 미생물을 프로파일하는 방법을 제공한다세미 양적 및 빠른 방법으로 종의 존재와 풍부한에 대한 추가 정보를 제공하면서 그램 얼룩이 ared. 이 멀티 플렉스 방식은 물론 현재 단일 샘플 ¹⁴ 5 ~ 6 가지 assays 제한됩니다 특히 생물에 대한 현재의 양적 PCR의 assays의 시야 밖으로 확장됩니다. 중요한 것은 방법이 질 면봉에 박테리아의 검출에 국한되지 않고 쉽게 빠르게 관심 거의 모든 미생물 커뮤니티의 프로필에 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 최근 폐수 처리 공장에 사용하기 위해 진단 도구의 개발이 방법론을 적용하기 시작했다.

Protocol

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이 방법은 Dumonceaux 외에 보고된 연구에 사용되었습니다. J. Clin. . Microbiol 47 4067-4077, 간접 : 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

전체 절차를 묘사한 도식 다이어그램 그림 1에 표시됩니다.

1. 비드 커플링

이것은 (표 2 참조) 폴리스티렌 Luminex 비즈에 oligonucleotide 프로브를 연결에 사용할 방법을 설명합니다. 볼륨은 시험 기준에 대한 새로운 캡처 프로브의 평가를위한 약간 적응되며 이러한 볼륨은 괄호 안에 표시됩니다.

-20 ° C의 dessicator에서 1 - 에틸 -3 - (3 - dimethylamiopropyl) carbodiimide HCL (EDC) 분말을 제거하고 실내 온도로 따뜻하게.
그리고 약 20 초 vortexing 20 초 동안 waterbath sonicator에서 sonciation하여 microspheres를 Resuspend.
(이것은 5x10 ⁶ 또는 1.25x에 해당 Eppendorf 튜브에 microspheres ....

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Discussion

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신호 생성의 특이성은 매우 중요합니다, 당신은 신호가 진정되는 유기체에서 발생 amplicon의 검출을 반영 관찰 확신해야합니다. 이러한 PrimerPlex (프리미어 Biosoft)와 같은 소프트웨어는 효율적으로 잡종을 것입니다 프로브를 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다,하지만 그들은 나 이외의 대상 종에 간 잡종 수도 있고 그렇지 않을 수도 있습니다. 범용 PCR primers의이 프로토콜에 설명된대로 사용하면 생성된 amplicon이 예제에있는 생물을 모두 나타내는 것을 명심하는 것이 중요합니다. 그것은 cpnDB, cpn60 UT 시퀀스의 데이터베이스 ¹⁶ 프로브 설계 소프트웨어에 의해 제안 시퀀스를 비교하여 상호 하이브 리다이 제이션의 가능성에 대한 잠재적인 프로브를 분석 그러므로 중요하다, 여러 생물과 일치하는 프로브는 피할 수있을 수도있다면 . 또한, 잠재적으로 특정 프로브가 확인되면, 우리는 유효성 검사를 탐사하는 방식을 데리고있는 복잡한 인공 테mplate는 관심 ^.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 분석 개발이 원고에 대한 비판적 의견과 관련하여 도움이 알베르토 Severini과 바네사 Goleski 감사드립니다. 이 작품은 캐나다의 보건 기관 및 산업 연구 지원 프로그램 (캐나다 국립 연구위원회)에 의해 재정 지원되었다. 추가 지원은 서스캐처원 출판물 기금의 대학에서 얻은 것입니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
Oligonucleotide 이름	회사	순서 ¹
H279BP	Invitrogen, IDT, 또는 기타	비오틴 - OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC
H280		YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT
H1612BP		비오틴 - OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC
H1613		CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT
^1O, phosphorothioate - C, E, phosphorothioate - G, F, phosphorothioate - A, I, 이노신, Y, C 또는 T, R, A 또는 G, K, T 또는 G, S, C 또는 G.

범용 cpn60 PCR에 대한 수정 oligonucleotides의 표 1. 시퀀스.

시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 - 에틸 -3 - (3 - dimethylamiopropyl) carbodiimide HCL (EDC)	찌르다	22,980
형광등 폴리스티렌 비즈 : MicroPlex Microspheres (Luminex) 또는 바이오 플렉스 COOH 비드 (바이오 RAD)	Luminex 또는 바이오 RAD	바이오 방사선 : 171 - 506xxx 엑스 비드 식별자에 해당하는 위치를	자기 구슬이 oligonucleotide 커플링 사용할지고 있으며 특정 이점을 제공할 수 있습니다. 이 작가에 의해 시도되지 않았습니다.
캡처 oligonucleotides (5 '아미노산 C12 수정)	Invitrogen, IDT, 또는 기타	여러	Desalted 순도 수준이 허용됩니다. 질 면봉을 특징하는 데 사용되는 캡처 프로브의 시퀀스는이 프로토콜은 ^13의 기반이되는 원고에 제공됩니다.
T7exonuclease	뉴 잉글랜드 Biolabs	M0263S
Streptavidin - R - phycoerythrin (SA - PE)	Invitrogen	S - 866	고순도 SA - PE를 구하는주의, 본 카탈로그 번호 권장합니다
Thermowell 96 잘 PCR 플레이트	어부	CS006509	96 - 웰 thermocycler 및 BioPlex 기계 모두에 맞게
Thermowell 밀봉 매트	어부	CS006555	다시 사용할 수 있으며, 비눗물로 씻어도 잘 린스 및 건조
5M TMAC	시그마	T3411
바이오 플렉스 또는 Luminex 악기	바이오 방사선 또는 Luminex	바이오 방사선 : 171-000201
프로브 설계를위한 PrimerPlex 소프트웨어	프리미어 Biosoft	www.premierbiosoft.com	Luminex 프로브 드를위한 제안다른 소프트웨어 플랫폼을 사용할 수 있지만, 서명

표 2. 특정 시약과 장비.

구성 요소	μl / 분석	μl/100 assays	최종 농도
10X PCR 버퍼 (Invitrogen)	5	500	1X
50 MM MgCl ₂ (Invitrogen)	2.5	250	2.5 MM
10 MM dNTP	일	100	0.2 MM 각
H279BP, 25 μm의	0.25	25	375 NM
H1612BP, 25 μm의	0.75	75	125 NM
H280, 25 μm의	0.25	25	375 NM
H1613,25 μm의	0.75	75	125 NM
물	34	3400	---
합계	44.5	4450

표 3. 수정된 cpn60 UT primers (표 1) PCR을위한 혼합을 제안했다. 분석은 템플릿 DNA와 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 (Invitrogen) 0.5 μl (2.5U) 5 μl에 대해 설정되어 있습니다. 일반적으로 대량의 준비 (100 assays에 대한 충분한 예) 및 -20 ° C.에 저장됩니다

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. Bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).
Hay, P. Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot. Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).
Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., ....

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