분리 LacZ를 표현 유동세포계측법를 사용하여 마우스 내이 (内耳) 조직의 세포를

요약

유세포 분석은 특정 세포 집단의 분리 및 연구를 가능하게 하는 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 신생아 형질전환 마우스의 달팽이관 조직에서 LacZ 발현 세포를 분리하는 단계를 설명합니다. 해리된 달팽이관 세포는 유세포 분석을 통해 분리하기 전에 β-갈락토시다아제의 형광 접합 기질을 사용하여 라벨링되었습니다.

초록

특정 세포 유형을 분리하여 줄기/전구 세포와 같은 희귀 세포 집단을 분석할 수 있습니다. 내이 조직을 연구하는 이러한 접근 방식은 관심 세포가 부족하고 형질전환 리포터 마우스 모델이 적기 때문에 독특한 도전 과제를 제시합니다. 여기에서는 형광 접합 프로브를 사용하여 신생아 달팽이관에서 LacZ 양성 세포를 선택적으로 라벨링하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

감각신경성 난청의 가장 흔한 기저 병리학은 음파를 신경 자극으로 변환하는 데 필요한 달팽이관 감각 유모 세포의 돌이킬 수 없는 손상과 손실입니다. 최근의 증거에 따르면 쥐의 청각 기관과 전정 기관에는 재생 잠재력을 가질 수 있는 줄기/전구 세포가 있다고 합니다^1,2. 이러한 발견은 줄기/전구 세포 특성을 가진 특정 세포 유형을 식별하는 것을 포함하여 추가 조사를 필요로 합니다. Wnt 신호 경로는 여러 장기 시스템에서 줄기/전구 세포 개체군을 유지하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었습니다^3-7. 우리는 최근 신생아 달팽이관에서 Wnt-responsive Axin2 발현 세포를 확인했지만, 그 기능은 대체로 알려져 있지 않습니다⁸.

in vitro에서 이러한 Wnt-responsive cell의 거동을 더 잘 이해하기 위해 Axin2-LacZ 리포터 마우스⁹의 달팽이관에서 Axin2 발현 세포를 분리하는 방법을 개발했습니다. 유세포 분석을 사용하여 신생아 달팽이관에서 Axin2-LacZ 양성 세포를 분리한 다음, 살아있는 세포에 대한 다양한 실험을 실행하여 줄기세포/전구세포로서의 세포의 행동을 조사할 수 있었습니다. 여기에서는 신생아 달팽이관의 현저해부, 이러한 조직의 해리, 형광 기질을 사용한 LacZ 양성 세포의 라벨링 및 세포 분류 단계를 자세히 설명합니다. 달팽이관을 단세포로 해리하고 유세포 분석을 통해 달팽이관 세포를 분리하는 기술이 기술되어 있습니다^2,10-12. 당사는 신생아 달팽이관에서 LacZ 발현 세포를 분리하기 위한 새로운 프로토콜을 확립하기 위해 이러한 기술을 수정했습니다.

프로토콜

1. 달팽이관의 미세해부

1. 70% 에탄올로 표면을 닦고 얼음 블록을 배치하여 후드 아래에서 해부 현미경을 준비합니다.
2. 멸균 상태에서 10-15개의 35mm 페트리 접시를 준비하고 멸균 Hank's Balanced Salt Solution with Calcium(HBSS)으로 절반(~2ml)을 채웁니다.
3. 멸균 상태에서 2개의 35mm 페트리 접시를 준비하고 멸균 1x 인산염 완충 용액(PBS)으로 절반(~2ml)을 채웁니다.
4. 50% 에탄올이 함유된 70ml 원추형 Falcon 튜브에서 마이크로 집게를 살균합니다.
5. 멸균 후드와 다른 방에서 홍채 가위를 사용하여 12-15 사후 (P) 0-3일 된 Axin2^LacZ/+ 리포터 마우스의 목을 베고 얼음 블록의 60mm 페트리 접시에 머리를 놓습니다.
6. #5 Dumont 집게와 홍채 가위를 사용하여 하악골과 혀를 절제하고 입천장 수준에서 두개골 기저부를 자릅니다.
7. calvaria의 위에 있는 피부를 제거하고 대공의 아래쪽 부분에 있는 가위를 입천장 중앙까지 삽입하여 두개골 기저부를 절제합니다.
8. 홍채 가위로 입천장의 절단된 가장자리에서 양쪽 칼바리아의 상부까지 다시 절개하고 이낭이 손상되지 않도록 주의합니다.
9. 대공(foramen magnum)의 상부(superior side)에서 시작하여 경구개(hard palate)의 관상절개(coronal cut)까지 뻗어 있는 두 개의 45도 각도 절개를 통해 측두골을 완전히 격리합니다.
10. HBSS가 포함된 35mm 페트리 접시에 분리된 측두골을 얼음 블록에 놓습니다.
11. 제물로 바쳐진 약 12-15마리의 동물로부터 시간뼈를 모아 총 24-30개의 시간골을 만든다.
12. 분리된 측두골이 있는 페트리 접시를 이전에 준비된 멸균 해부 후드(1.1)로 옮깁니다.
13. HBSS(1.2)가 들어 있는 미리 준비된 35mm 페트리 접시 각각에 4개의 측두골을 옮기고 얼음 블록에 놓습니다.
14. 두 개의 #55 겸자를 사용하여 이낭 위에 있는 측두골의 피질, 뇌간 및 소뇌를 부드럽게 제거하기 위해 미세 해부를 시작합니다.
15. 이낭을 제거하지 않고 전정 신경의 입구에서 시작하여 인공와우낭의 일부를 이낭으로 조금씩 떼어냅니다.
16. 달팽이관 기저부가 노출된 후 달팽이관과 주변 조직을 부드럽게 당겨 빼냅니다. 남아있는 나선형 신경절과 기저부에서 시작하는 선조혈관을 제거합니다.
17. 달팽이관을 얼음 블록에 PBS가 들어 있는 35mm 페트리 접시로 옮깁니다.
18. 최적의 조직 생존력을 위해 총 해부 시간은 60분 미만이어야 합니다.
19. Axin2-LacZ 마우스에 대한 대조군으로 3-5 야생형(WT) P0-P3 마우스에 대해 위 단계를 반복합니다.

2. 세포 해리 (앞서 설명한 방법에서 수정 됨) ^2,10

1. 50μl의 멸균 PBS를 6웰 코팅되지 않은 배양 접시의 웰 중앙에 놓습니다.
2. 최대 20개의 Axin2^LacZ/+ 달팽이관을 PBS의 각 50μl 방울로 전달합니다. 20개 이상의 달팽이관에는 새로운 50μl 방울의 PBS를 사용해야 합니다.
3. 0.125% 트립신의 50μl 분취액을 37°C 수조에서 ~2분 동안 예열합니다.
4. 달팽이관이 포함된 PBS에 예열된 0.125% 트립신 50μl를 추가합니다.
5. 6웰 접시를 37°C에서 8분 동안 놓고 접시가 흔들리지 않도록 주의합니다.
6. 트립신화를 종결하려면 각 100μl 액적에 50μl의 대두 트립신 억제제를 첨가합니다.
7. 50μl의 전체 매체(FM)(IGF-1, EGF, bFGF, HS, DMEM/F12의 암피실린)^{를 추가합니다.2}
8. p200 피펫맨이 125μl로 설정된 300μl의 뭉툭한 피펫 팁을 사용하여 기포가 생성되지 않도록 주의하면서 세포를 80회 부드럽게 분쇄합니다.
9. 각 액적을 분쇄한 후 각 웰에 200μl의 FM을 추가로 첨가합니다.
10. 40μm 파란색 Falcon 세포 여과기를 통해 세포를 새 웰로 통과시킵니다.
11. 세포를 표준 Falcon FACS 튜브로 이동합니다(분쇄 및 여과 후 약 300μl 잔류).
    1. 야생형 달팽이관의 세포를 3개의 튜브로 분할하고 각 튜브에 100μl를 300μl FM으로 희석합니다. 하나의 튜브는 블랭크 대조군으로 사용되고, 하나는 프로피듐 요오드화물(PI, 1 μg/ml)로만 염색되며(이 단계에서는 추가되지 않음), 마지막 튜브는 배경 형광을 검출하기 위해 3-카르복시움벨리페릴 β-D-갈락토피라노사이드(CUG, 2.15 참조)로 염색됩니다.
    2. Axin2-LacZ 달팽이관에서 해리된 세포 400μl를 각 FACS 튜브에 배치합니다. CUG 전용 대조군으로 10μl의 세포를 390μl FM으로 희석합니다(2.15단계의 튜브 F 참조). 남은 튜브의 부피를 400μl로 가져옵니다.
12. 37°C 가습 인큐베이터에서 10분 동안 세포를 배양합니다.
13. CUG 솔루션 준비:
    1. 염색이 필요한 각 FACS 튜브에 대해 200μl의 CUG를 준비합니다.
    2. FM 1:50의 CUG를 최소한의 빛 노출로 어두운 후드에서 희석합니다.
    3. 희석된 CUG를 37°C에서 3-5분 동안 예열합니다.
14. 다음으로, 200μl의 희석된 CUG를 각 적절한 FACS 튜브에 추가합니다. CUG가 있도록 지정되지 않은 튜브의 경우 FM만 추가합니다(2.15 참조).
15. 이 시점에서 다음과 같은 내용물을 가진 5가지 범주의 튜브가 있어야 합니다(이 단계에서 PI를 추가하지 마십시오).
    1. 와일드타입 - CUG 또는 PI 없음(보정은 3.5-6단계 참조)
    2. 와일드타입 - PI만 포함(보상용)
    3. 와일드타입 - CUG 및 PI 포함(Axin2-LacZ 세포 제어용)
    4. Axin2-LacZ - CUG 전용(보상용)
    5. Axin2-LacZ - CUG 및 PI 포함(실제 세포 분류용)
    6. Axin2-LacZ - CUG 및 PI 포함(이벤트 분석용)
16. 모든 튜브를 빛으로부터 보호하고 37°C 가습 인큐베이터에서 25분 동안 배양합니다.
17. 배양 후 반응 중단을 위해 새로운 HEPES + Fetal Bovine Serum (FBS) 용액을 준비합니다.
    1. 15ml Falcon 튜브에 멸균 10mM HEPES (PBS) 10ml에 갓 해동 한 FBS 400 μl를 희석합니다.
    2. 2.16이 완료될 때까지 얼음 위에 튜브를 놓습니다.
18. 빛 노출을 최소화하기 위해 불을 끈 멸균 후드 아래의 각 FACS 튜브에 1.8ml의 얼음처럼 차가운 HEPES 용액을 추가합니다.
19. 1200rpm에서 5분 동안 원심분리기 셀.
20. 300μl FM에서 상층액을 제거하고 세포를 다시 현탁시키고, 분류 샘플(CUG 및 PI로 염색된 Axin2-LacZ)에 대한 모든 부분 표본을 풀링합니다.
21. 각 튜브에 PI를 추가하여 1μg/ml의 최종 농도를 달성합니다.
22. 얼음 위에 세포를 놓고 빛으로부터 보호하십시오.

3. 유세포 분석

1. 우리는 488nm, 633nm 및 407nm 레이저가 장착된 BD Aria II를 사용합니다. CUG 감지는 Stanford Shared FACS Facility에서 407nm 보라색 레이저를 사용하고 PI는 488nm 청색 레이저를 사용하여 수행되었습니다.
2. 숙련된 유세포 분석기 작업자가 필요합니다. 레이저를 예열하고, 제조업체 지침에 따라 세포분석기 검출기를 보정하고, 최적의 분류 매개변수를 설정한 후 다음 단계로 진행합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 100μm 노즐을 사용하면 후속 실험을 위한 세포 생존율이 최적화된다는 것을 알게 되었습니다.
3. 5,000 이벤트의 임계값, 3,000 이벤트/초 미만의 유속, 125볼트에서 전방 산란(FSC) 및 250볼트에서 측면 산란(SSC), PI에는 PE-Cy5 채널, CUG에는 Cascade Blue가 사용되었습니다.
4. 세포분석기 챔버를 70% 에탄올과 PBS로 각각 2회 순으로 플러시합니다.
5. 염색되지 않은 야생형 세포(2.15단계의 튜브 A)로 분석을 시작합니다. 1,000개의 이벤트를 수집하여 FSC 대 SSC 플롯에서 세포 분포를 확인할 수 있습니다. 산란을 원하지 않는 경우 FSC 및 SSC 매개변수를 조정하십시오.
6. 염색되지 않은 WT(튜브 A), PI 염색된 WT(튜브 B) 및 CUG 염색된 Axin2-LacZ(튜브 D) 세포를 사용하여 보정을 수행합니다. 보정을 통해 서로 다른 레이저 파장 간에 보다 정확한 신호 식별이 가능합니다.
7. 야생형 PI 및 CUG 염색 세포(튜브 C)로 분석을 시작하고 다음에 대한 게이팅 매개변수를 설정합니다.
   1. FSC 대 SSC 플롯을 기반으로 한 파편 제외.
   2. FSC-높이 대 FSC-면적 플롯을 사용한 이중선 및 덩어리 제외.
   3. FSC-면적 대 PE-Cy5-면적 플롯을 기반으로 한 사멸 세포 제외.
   4. 게이트 배치와 함께 FSC 영역 대 캐스케이드 블루 영역의 플롯을 설정합니다.
8. 다음으로, Axin2-LacZ PI 및 CUG 염색 세포(튜브 F)가 포함된 분류 샘플 튜브에서 10,000개의 이벤트를 분석합니다.
   1. 야생형 셀을 사용하여 설정된 모든 게이트를 여기에 적용해야 합니다.
   2. 야생형 셀에 대한 플롯을 사용하여 총 이벤트 수의 1% 미만인 Cascade Blue-high 셀에 대한 게이트를 만듭니다.
   3. Cascade Blue-high의 동일한 게이트는 이제 Axin2-LacZ 샘플에 있는 세포의 약 15-20%를 포함하여 이러한 Axin2-high 세포를 만듭니다.
   4. Axin2-LacZ 세포의 분석 플롯을 사용하여 최소 형광 15-20%의 세포, 즉 Axin2-low 세포에 대한 게이트를 만듭니다.
9. 앞서 언급한 게이팅 전략에 따라 세포를 500μl FM을 포함하는 FACS 튜브로 분류하고, 한 튜브는 Axin2-high 세포용이고 다른 하나는 Axin2-low 세포용입니다. 분류하는 동안 수집 튜브가 4°C로 냉각된 챔버에 있는지 확인하십시오.
10. 각 집단에 대해 유세포 분석기로 계수된 세포 수를 기록합니다.

4. 대표 결과(그림 2 참조):

위의 프로토콜을 사용하면 일반적으로 야생형과 Axin2^LacZ/+ 달팽이관에서 40-45%의 파편이 없는 세포를 회수할 수 있으며(그림 2A 및 B) 이 중 약 70%는 이중선이 없습니다(그림 2A' 및 B' 참조). 대부분의 분류된 세포는 생존 가능하며 PI(~95%)를 차지하지 않았습니다(그림 2A'' 및 B''). 평균적으로, 상위 ~20% CUG 양성 세포는 Axin2-LacZ 양성 세포로 간주되며(그림 2B''') 10-12마리당 약 15,000개의 Axin2-LacZ 높은 세포와 상관관계가 있습니다.

Axin2 높은 세포의 유세포 분석 재분류 분석은 Cascade Blue 채널에서 93% 이상의 순도를 나타냈습니다. 이러한 세포의 정체를 추가로 확인하기 위해 항β-갈락토시다아제 항체를 사용하여 Axin2-high 및 Axin2-low 세포 모두에 대해 post-sort immunostaining을 수행했으며, Axin2-high 세포에는 ~93.4%의 β-갈락토시다아제 양성 세포(분석된 1,500개 이상의 세포)가 포함되어 있고 Axin2-low 세포에는 ~4.8%의 β-갈락토시다아제 양성 세포가 포함되어 있음을 발견했습니다.

그림 및 표:

그림 1.실험적 패러다임. 위의 그림은 프로토콜 섹션을 통해 설명된 전반적인 실험 전략 및 기술을 보여줍니다. 야생형 및 Axin2^LacZ/+ 마우스의 달팽이관을 수확하여 단일 세포로 해리한 다음 β-갈락토시다아제의 형광 기질인 CUG로 처리했습니다. 그런 다음 Axin2-LacZ-high 및 -low 세포를 유세포 분석을 통해 분리했습니다. 이 이미지의 전체 크기 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2.게이팅 전략. 이 그림은 사용된 유세포 분석 게이팅 전략을 보여줍니다. A) Axin2-LacZ 세포와 동일한 처리를 거친 해리된 야생형 세포는 총 10,000개의 이벤트를 사용하여 여기에서 분석됩니다. 첫 번째 패널은 측면 산란 영역(SSC-A) 대 전방 산란 영역(FSC-A)을 보여줍니다. 여기서 별개의 이벤트 그룹은 y축에 가까운 이벤트보다 훨씬 더 큰 크기입니다. 이러한 이벤트는 "Debris Negative"로 지정됩니다. 다음 게이트인 A'는 전체 이벤트 수의 43.8%에 해당하는 패널 A의 "Debris Negative" 셀을 분석합니다(아래 표 참조). 이 패널에서는 FSC-A에 대한 전방 산란 높이(FSC-H)를 사용하여 이중선을 제외합니다. 플롯의 예상 선형 특성에서 벗어나는 이벤트는 제외됩니다. 이 제제는 일반적으로 지정된 게이트 내에서 ~70%의 이벤트를 생성하며 나머지 셀은 제외됩니다. 패널 A''에서 PE-Cy5 채널에 의해 검출된 요오드화프로피듐(PI)은 죽은 세포(5.3%)를 표지하는 데 사용됩니다. 다음 패널(A''')에서 캐스케이드 블루 채널은 형광 기판 CUG를 감지하는 데 사용됩니다. 여기서 LacZ 상위 게이트는 전체 이벤트의 1% 미만을 포함합니다. B) CUG 및 PI로 처리된 Axin2-LacZ 마우스의 해리된 세포는 총 10,000개의 이벤트를 사용하여 여기에서 분석됩니다. 패널 A의 동일한 게이트가 여기에 적용됩니다. B'는 세포의 29.5%가 이중선으로 제외되었음을 보여주고 B''는 5.4%가 생존 가능하지 않음을 나타냅니다. LacZ-high 및 -low 셀의 초기 게이트는 초기에 LacZ-high를 19.7%로, LacZ-low를 20.4%로 설정한 패널 B'''를 사용하여 그려집니다. 이 이미지의 전체 크기 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

<테이블 테두리="1">     이벤트 번호 백분율 ᅡ 야생형 분석 10,000명   ᅡ' 파편 네거티브 4,381명 43.80% 에이'' 이중항 네거티브 3,116명 71.10% 아''' PI 네거티브 2,951명 94.70%   LacZ-높음 16세 0.54%   LacZ-낮음 2,790명 94.50% 비 Axin2-LacZ 분석 10,000명   비' 파편 네거티브 4,218명 42.2% 비'' 이중항 네거티브 2,973명 70.50% 비''' PI 네거티브 2,813명 94.6%   LacZ-높음 553의 19.70%   LacZ-낮음 573명 20.40%

표 1. 그림 2의 게이팅 전략에 대한 정량적 분석.

토론

독립적인 연구는 신생아 달팽이관 내에서 제한된 재생 능력을 특징으로 했습니다^2,10,12,13. GFP-리포터 마우스와 유세포 분석을 사용하여 White와 동료들은 특정 달팽이관 지지 세포를 분리하여 전구 세포 특성을 갖는다는 것을 발견했습니다¹².

표준 Wnt 경로는 뇌, 유선, 조혈계, 피부 및 위장관 장 선와를 포함한 여러 장기 시스템에서 줄기/전구 세포 집단을 표시하는 것으로 입증되었습니다. 최근 연구에서는 신생아 달팽이관의 잘 특성화되지 않은 세포 집단에서 활성 Wnt 신호 전달을 발견했습니다⁸. Axin2-LacZ 리포터 마우스⁽⁹ )는 다른 시스템에서와 마찬가지로 달팽이관⁸ 에서 활성 Wnt 신호 전달에 대한 충실한 판독값을 생성합니다^5,7. 이 Axin2-LacZ 양성 세포 집단을 더 잘 특성화하기 위해 신생아 달팽이관에서 재생을 조절하는 Wnt 신...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
페트리 접시, 폴리스티렌, 멸균 Geriner Bio-one 35 x 10 mm	VWR 국제	82050-540
BD 팔콘 세포 여과기, 멸균, BD Biosciences, 파란색, 40 μ m	VWR international	21008-949
행크스 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS). 칼슘, 마그네슘 및 페놀 레드가 없는 용액, 멸균	VWR international	45000-456
Cellstar 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌, 멸균, Greiner Bio-one, 50 ml	VWR international	82050-346
Cellstar 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌, 멸균, Greiner Bio-one, 15 ml	VWR international	82050-278
B-27 무혈청 보충제 (50x), 액체	Invitrogen	17504-044
N-2 보충제 (100x), 액체	Invitrogen	17502-048
bFGF, 섬유아세포 성장 인자-기본 인간	Sigma-Aldrich	F0291
IGF-1, 마우스	Sigma-Aldrich	I8779
EGF, 표피 성장 인자 인간	Sigma-Aldrich	E9644
Dulbecco'에서 인슐린 유사 성장 인자-1 의 변형된 독수리' s 미디엄/햄' s F-12 50/50 믹스 : 1X, L- 글루타민 및 15 mM HEPES < / p>	VWR 국제	45000-350 < / >
BD 팔콘 둥근 바닥 튜브, 일회용, 폴리스티렌, 12x75 < / p>	VWR 국제	60819-295 < / p>
트립신, 0.25 % (1X) EDTA 4Na, 액체 < / p>	Invitrogen	25200-056 < / p>
ep Dualfilter TIPS 300uL, 960 TIPS	Eppendorf	22491245
트립신 억제제, 대두, 정제	Worthington Biochemical	LS003570
BD Falcon 40um Cell Strainers	BD Biosciences	21008-949
멀티웰 플레이트, 폴리스티렌, Greiner Bio-One, 비처리 플레이트, 6 웰	VWR international	82050-846
Marker Gene FACS Blue LacZ beta-Galactosidase Detection Kit	Marker Gene Technologies	M0255