의 정량 및 자동화된 고속 처리량 게놈 전체의 RNAi 화면 C. elegans

DOI: 10.3791/3448

February 27, 2012

Barbara Squiban¹, Jérôme Belougne¹, Jonathan Ewbank¹, Olivier Zugasti¹

¹Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy,Université de la Méditerranée

날 2

4. 96 - 웰 NGM RNAi 플레이트쪽으로 종자 RNAi 세균성 클론을

이 단계 ON 문화에 따라 아침에 수행되어야한다.

1. 4에서 96 - 웰 NGM 번호판을 가지고 ° C와 그들 무균 층류 캐비닛 아래에서 5-15 분 동안 워밍업 말리면. 그렇지 않으면 NGM 그 후 크랙 수 있으므로 너무 오래 후드 (최대 30 분) 아래 번호판을 두지 마십시오. 각 플레이트에 적절한 라벨 / 바코드를 추가합니다.
2. 37 ° C.에서 배양 접시에 96 DeepWell를 검색 빈 우물 (빈 우물이 완전히 투명입니다)의 위치를​​ 기록, 이들은 이후의 분석에서 제외됩니다.
3. 96 원심 분리기- DeepWell 접시 4,000 rpm으로 5 분 거리에 있습니다.
4. 급격히 거꾸로 접시를 돌려 종이 타월에 급속하게 접시의 가장자리를 건조하여 표면에 뜨는 오프 팁. 문화가 재조합 박테리아의 위치로 뜨는는 현지 법규 (예 : autoclaved)에 따라 취급해야합니다.
5. 이상적으로 각 플레이트가 정확히 같은 대우를받는 있도록 전용 교반기 (예 Tecan)를 사용, vortexing하여 잔류 액체 (약 50 μL)에서 세균 펠렛을 Resuspend. 그것은 이후의 단계에 대한 정확 세균성 inoculum을 표준화하여 각 무사히 OD _600을 측정할 수도 있지만 이것은 필수 아닌, 우리는 이러한 검사를 수행하지 않습니다.
6. 8 또는 12 채널 멀티 피펫을 사용하여 96 - 웰 플레이트에 NGM resuspended 박테리아의 5 μL를 전송합니다. NGM을 만지거나 침투하지 않도록주의하십시오. 이 단계를 수동으로 수행되지만 같은 Liquidator96 (비가)로 로봇을 사용하여 최적화할 수 있도록 그한 번에 96 RNAi 클론의 분포.
7. NGM가 너무 건조되기 피하기 위해 정기적으로 점검, 무균 층류 캐비닛 아래 박테리아가 건조하자. 이 단계는 2 시간 정도 소요됩니다.
8. 습기 챔버 안에 37 ° C에서 96 잘 RNAi-NGM 번호판을 품어.

5. 벌레의 동기 인구를 준비

이 단계에 대해서는 관심 리포터 유전자 (들) (감염-inducible P nlp-29 :: GFP 구조를 예를 들어 있으며, 내부 통제로 제정 P 중령-12 :: dsRed transgene은 건설) 운반 유전자 변형 웜을 사용 . 때문에 시간이 transgene 표현의 관찰된 감소에 대해, 우리는 벌레 매 6 주간의 신선한 배치를 녹여. 우리는 문화를 사용하기 전에 최소한 2 세대에 대한 웜 및 웜는 분석하기 전에 굶어 죽었 적이 있는지 확인하십시오. 프로토콜의 제 2 일 화요일이라면, 우리는 OP50 박테리아 확산 9cm의 NGM 플레이트 30 젊은 성인 벌레를 배치하여 금요일에 벌레를 준비20 ° C에서, 그들은 화요일 (표 1 참조)에 표백제에 준비가 될 것입니다.

1. 표준 프로토콜 ¹⁰ 다음 표백 웜.
2. 계란은 L1의 애벌레의 동기 인구를 위해 동요와 25 ° C에서 M9에서 부화하자.

3 일

6. 수유와 RNAi를위한 96 - 웰 RNAi-NGM 플레이트에 벌레를 배포

이 단계는 아침에 수행되어야한다. L1 단계 동기 벌레는 먹이와 RNAi 각 96도 세균성 클론에 배포됩니다.

1. 37 ° C에서 96 잘 RNAi-NGM 플레이트를 검색하고 다운 냉각 실내 온도에서 그들을 두십시오.
2. 25 ° C.에서 표백된 벌레를 검색 2 μL 당 벌레의 수를 산정 2 μL 당 주위 100-120 벌레를 (대략 한 방울)해야 M9로 조정합니다.
3. 수동 반복 디스펜서를 사용하여 각 우물에 L1 단 웜 2 μL를 배포합니다. 웜 (당신이 액체에서 수영 벌레를 볼 수)에 대한 각 우물을 확인합니다.
4. 멸균 층류 캐비닛 (최대 1 시간) 아래에있는 번호판을 말리면. 정기적으로 번호판을 확인하고, 벌레가 기어와 수영을 안해야합니다. 조심해, NGM가 너무 건조해서는, 그렇지 않으면 그것은 균열 것입니다.
5. 습기 챔버에서 25 ° C에서 접시를 놓습니다.

7. 효과적인 감염 Drechmeria coniospora의 포자를 테스트

이 단계는 현재의 화면에만 적용됩니다. 그것은 고도로 infective의 것들을 선택 포자의 다양한 배치를 테스트로 구성되어 있습니다. 따라서는 하루에 4, 감염의 전날, 가장 가까운 가능한 일을해야합니다. 그것은이 테스트 (표 1)에 대해 사전에 충분한 L3-L4 웜을 준비가 필요합니다. D.에 필요한 세부적인 방법 coniospora 문화는 다른 ¹¹ 설명되어있다.

4 일

8. D.과 RNAi 노출된 웜 감염 coniospora의 포자

이 단계 30시간 RNAi 벌레가 L3-L4 단계에 도달했을 때 수유 이후에 수행됩니다.

1. 당도 4 μL를 배포하는 데 사용할 수있는 포자의 볼륨을 결정합니다.
2. 신선한 시각을 수집 M9 버퍼로 선택한 배치에서 coniospora의 포자. 포자의 하나 9cm 판 위해 M9의 8-10 ML을 사용합니다.
<리> 반복 디스펜서 각도에 포자의 4 μL를 배포합니다. 포자 (당신이 액체에서 벌레 수영장을 볼 수)에 대한 각 우물을 확인합니다.
3. 멸균 층류 캐비닛 (~ 1 시간) 아래에있는 번호판을 말리면. 벌레가 크롤 링을 시작하기 전까지 정기적으로 번호판을 확인합니다. 조심해, NGM가 너무 건조해서는, 그렇지 않으면 그것은 균열 것입니다.
4. 습기 챔버에서 25 감염된 접시 ° C를 놓습니다.

5 일

9. 자동 정량 분석​​하기 전에 접시의 관측 및 저장

이 단계는 감염 후 18 시간이 시작되고 5 일 동안 수행됩니다. 벌레가 알을 낳기 시작한 젊은 성인이 될 것으로 예상된다. 이 단계 동안 표현형는 시각 득점됩니다 중 웜은 일반적인 상황에 따라 감염에 해당하는 녹색 형광, 또는 GFP의 유도는 즉 주어진 우물로 변경되어 침묵 유전자 변화 감염에 대한 응답.

<리> 신속 형광 해부 현미경으로 번호판을 관​​찰합니다. 접시가 좋은 일반 GFP 유도 보여주면 다음 단계로 진행, 그렇지 않으면 한 벌레 만도 남은 음식이 여전히 존재로, 더 유도를 위해 오후 때까지 기다립니다.
1. 시각마다 접시 점수 및 표시 표현형 (GFP에 대한 표현 예 없음)으로 모든 잘 적어 둡니다. 추가되었을 수있는 컨트롤 RNAi의 클론으로 얻은 결과를 확인함으로써,이 첫 번째 예비 분석 실험 성공 여부의 표시를 제공합니다.
2. 로, NaCl 50 MM-트리톤 0.05 %의 100 μL와 8 또는 12 채널 멀티 피펫 송금에게 벌레를 사용하여 새로운 correspondingly 라벨 / 96 잘 둥근 바닥 플레이트 barcoded. -80에서 번호판을 고정 ° C에서 분석까지.
3. 분석의 날, 상온에서 번호판을 녹여하고 COPAS Biosort를 사용하여 자동화된 분석을 수행합니다. 분류기는 22 분 안에 하나의 접시를 분석합니다. 접시는 안분석하기 전에 한 시간 이상 상온에서 왼쪽으로, 그들은 다시 냉동 수 없습니다.
4. COPAS Biosort에서 얻은 정보는 데이터 품질의 간단한 검증을위한 엑셀 파일에 베꼈는데됩니다. COPAS Biosort (세 가지 다른 감지기에 의해 동시에 광학 밀도 (멸종), 축방향 길이 (비행 시간), 형광 방출)에 의해 측정하는 여러 매개 변수를 원시 데이터는 전용 LIMS 패키지 (MBio LIMS에 저장됩니다 Modul- 이후 상세한 정량 분석​​을위한 바이오).

10. 대표 결과

대부분의 우물에서 실험 끝에, 위에 주어진 웜 및 박테리아의 수량을 이용하여 동물은 모든 성체로 개발해야하며 여전히 우물에 남은 음식이 있어야합니다. 이러한 조건에서 가장 웰스는 또한 계란을 포함해야합니다. 그럼 잘 Biosort 데이터 f를 구할 것을 각각 성인의 충분한 숫자가 있어야합니다또는 적어도 50 개인 웜. RNAi가 효과적인 경우 반면에, RNAi의 클론 많은 수의 보이는 표현형을 자극합니다. 예를 들어, 웜은 uncoordinated, 또는 좀 더 확실히, 멸균, 또는 자신의 발전에 체포 될 수도 있습니다. 이것은 일반적으로 잘 96 - 웰 플레이트마다 적어도 하나는 분명 RNAi의 표현형와 웜을 포함하고 있으므로, 자주 발생한다. 관심 표현형는 GFP 리포터 유전자의 표현되면, GFP (RNAi) 클론있는 우물은 강력한 컨트롤 (그림 2)를 제공합니다. 같은 크기의 변화와 같은 다른 phenotypes는 쉽게 Biosort (그림 3A)로 측정할 수 있습니다. 우리는 잘있는 음식이 밖으로 대조해 보니 벌레가 매우 낮은 주파수 (<1 %, 학사되지 않은 결과)에 인접한 우물로 마이 그 레이션 있다고 보여집니다.

유전자의 다른 클래스의 함수를 쓰러뜨린 것은 C.에서 transgenes 표현에 영향을 미칠 수 elegans. 일부가 아닌 구체적 transgenes 표현 ¹² 필요합니다. 기타 등조직 특정 전사 인자로서, 예를 들면 표피 GATA 계수 ELT-3 ^13, 세포의 특정 하위 집합에 필요합니다. 이것은 현재 프로토콜에 사용되는 변형의 비 관련 및 구성적인 표피 세포 transgene 기자 구문 (P 중령-12 :: dsRed)에 포함하는 이유 중 하나입니다. 여기에는 유전자가 특별히 연구 미만 유전자 규제 프로세스 (그림 3B & C)에 관련된 분들 구분할 수 있습니다. 이것은 transgene은 모든 애벌레 단계 동안 표시됩니다. 검정은 배아에서 감지 유전자 발현과 관련된 경우 다른 제어 리포터 유전자가 필요됩니다.

이 프로토콜의 혁신 중 하나는 그들의 분석을 연기하기 위해 냉동 플레이트의 사용이다. 동결은 번호판이 실질적으로 결과를 변경하지 않고도 2 주가에 저장할 수 있습니다. 측정된 형광의 절대 값이 변경될 수 있지만, 그들의 상대적인 비율은 (그림 4)와 유사한 남아 있습니다. 에게도에그녀의 손이, RNAi는 본질적으로 변수 실험 절차 ^14입니다. 강력한 결과를 얻을 수 있으며 많은 잠재 잘못된 반응을 제거하기 위해 RNAi 스크린은 최소 한 번 복제해야합니다. 실험이 성공적으로 실시하는 경우, 다른 날짜에 검사를 한 접시의 결과 사이에 합리적인 상관 관계가 있어야합니다. 특히, 강한 효과를 유전자들의 정확한 양적 효과가 중복 플레이트 (그림 5) 사이에 동일하지 않더라도 명확하게 식별해야합니다.

그림 1. 전형적인 실험을위한 종합 계획.

그림 2. 제어 RNAi는 GFP 발현을 대상으로 클론을 사용합니다. 유전자 변형 웜 expressiNG constitutively AP 열-12 :: dsRed 기자와 inducible P nlp 29 :: 96 - 웰 플레이트에서 고체 중간에 GFP 기자는 적색과 녹색의 형광을 동시에 관찰을 허용 필터 세트와 함께 현미경을 해부 GFP를 사용하는 시각. 웜는 제어 (상단 패널) 또는 48 H를위한 GFP RNAi 클론 (하단 패널)에 노출되었다. 왼쪽 패널은 18 시간 D.과 감염 후 감염되지 않은 웜, 웜 오른쪽에있는 사람입니다 coniospora. 눈금 막대는 1mm입니다.

그림 3. 96 - 웰 플레이트의 정량 분석. COPAS Biosort는 분석 각각의 벌레에 대해 수치 데이터를 생성합니다. 웜 ^15, 적색 형광 (B) 및 유전자 변형 하고요의 TOF에 녹색 형광의 비율 (X100) (C)의 크기에 해당합니다; 그래프 비행 시간에 대한 평균 및 표준 편차 (TOF)를 표시RMS는 constitutively 표현 AP 열-12 :: dsRed 기자와 inducible P nlp 29 :: 18시간 D.과 감염 후 48 H에 대해 서로 다른 RNAi 클론과 함께 96 - 웰 플레이트에 고체 배지에 배양해 있었다 GFP 기자, coniospora. 예 (), 자극의 성장 결함 및 / 또는 P 중령-12 :: dsRed의 표현에 영향을 미칠에서 화살표로 강조 하나로서 특정 클론. (C)에서 화살표로 강조 표시된대로 기타 구체적으로, GFP 발현에 영향을 미칩니다. 이 특정 클론은 이전 nlp 29 ¹³ 조절에 중요한 것으로 표시된 유전자 nsy 1을 대상으로하고 있습니다. 녹색, 적색 형광 및 TOF는 임의하지만 일정한 단위로 측정됩니다.

4 그림. 검색같은 실험에서 라이브 및 냉동 샘플로 얻은 데이터 arison. P nlp-29 :: GFP 및 P 열-12 :: dsRed transgenes 들고 L4 웜의 플레이트는 하나 라에 감염되었다 coniospora 여부. 18H 후, 각각의 플레이트는 대략 2 나뉘어되었다; 절반 즉시 분석과 해동 및 분석하기 전에 절반 24 시간 동안 -80 ° C에서 냉동되었다. 평균 TOF (벌레의 크기), EXT (광학 밀도) 및 녹색과 빨간색 형광 값은 각 샘플에 대해 계산되었습니다. 그래프는 평균의 비율을 표시하지 않은 감염된 샘플로 나눈 감염, 냉동 및 라이브 샘플 (각각 n은 = 7638와 5096와 8634와 3850 웜).

그림 5. 중복 96 - 웰 플레이트의 비교 분석. 정규화된 형광 비율 (평균 형광 비율 (여기서, 100 각각 잘 수로 나눈위한 * 녹색 / TOF)대표 96 - 웰 플레이트의 중복 분석에서 각 잘 대해 (25 ^일 ~ 75 ^번째 백분 위수) 각 플레이트에 대해 의미) 손질.

표 1. 30 접시와 한 사이클 실험의 예.

여기는 구일에 조직된 12 단계로 1 단계의 실험 30 접시의 한 사이클 실험 및 타임 라인에 필요한 자료를 제시하고 있습니다.

선충류 성장 미디어 (NGM), 100 ML :

96 - 웰 플레이트, 100 ML의 RNAi 치료를위한 NGM :

블리치 솔루션, 5mL :

2.5 ML H ₂ O
2.3 ML의 블리치
0.2 ML NaOH 50%

NaOH 50 %, 100 ML :

50g NaOH
100 ML에 탈이온수 추가

NaCl 50mM-트리톤 0.05 %, 400 ML :

4 ML NaCl 5 M
한 ML 트리톤 20%
400 ML에 탈이온수 추가

이 ML 트리톤 X-100
8 ML 탈이온수

M9 버퍼, 1L

6g 나 ₂ HPO ₄ (MW : 178)
3g KH ₂ PO ₄ (MW : 136)
5g NaCl
한 패로 탈이온수 추가
압력솥
한 ML MgSO ₄ 1 M 추가

Luria 국물 (LB) 1L :

10g BactoTryptone
20g의 효모 추출물
10g NaCl
한 패로 탈이온수 추가
압력솥

1 M MgSO _4, 300 ML :

73.95 g MgSO ₄
300 ML에 탈이온수 추가
상온에서 압력솥 및 매장

5 MG / ML의 콜레스테롤, 200 ML :

1g의 콜레스테롤
200 ML에 100 % EtOH 추가
소독 필터링하고 실온에서 보관

1 M CaCl _2, 500 ML :

27.75g CaCl ₂
500 ML에 탈이온수 추가
소독 필터링하고 실온에서 보관

1 M KPO ₄ 산도 6.0, 4 패 :

517g KH ₂ PO ₄ (MW : 136)
207g K ₂ HPO ₄ (MW : 174)
4 패로 탈이온수 추가

100 MG / ML 암피실린 (앰프), 10 ML :

1g 암피실린
10 ML에 탈이온수 추가
-20 ° C에서 저장

1 M 이소 프로필 β-D-Thiogalactopyranoside (IPTG), 10 ML :

2.38 g IPTG
10 ML에 탈이온수 추가
-20 ° C에서 저장

12.5 MG / ML 테트라 싸이클린, 100 ML

1.25 g 테트라 싸이클린
100 ML에 100 % EtOH 추가

표 2. 솔루션.