기계 군은 폐 개발 및 폐 부상에서 핵심적인 역할을한다. 여기서는 쥐 태아의 폐 유형 II 상피 세포 및 섬유아 세포를 분리하고 사용하여 기계적인 자극에 노출하는 방법을 설명 체외에서 시스템.
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이 논문에서
요약
초록
반복적인 호흡과 같은 움직임 의해 유체 팽만에 의한 utero에서 생성된 기계적 세력은 정상 폐 개발을위한 중요합니다. 폐 개발의 핵심 구성 요소는 폐포 유형 II 상피 세포, 폐 계면 활성제의 주요 소스의 차별화입니다. 이러한 세포는 폐포 루멘, 호스트 방어 및 부상 수리에 유체 항상성에 참여합니다. 또한, 말초 폐 실질 조직 세포를 직접 출산 후 기계적 환기 중 과장 확대 해석에 노출됩니다. 그러나 폐암 세포가 폐 발달에 영향을 미치는하고 폐 손상을 촉진하기 위해 기계적인 자극을 감지하는 정확한 분자 및 세포 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 여기서는 쥐 태아의 폐가에서 2 형 세포와 섬유아 세포를 분리하기위한 간단하고 고순도 방법을 제공합니다. 그렇다면, 우리는에 기계적 힘을 시뮬레이션, 태아 세포에 기계적 자극을 제공하기 위해, 체외 시스템, Flexcell 스트레인 단위에 대해 설명태아의 폐 발달이나 폐 부상. 이 실험 시스템은 신축에 노출 태아의 폐 세포에서 분자 및 세포 메커니즘을 조사하기위한 훌륭한 도구를 제공합니다. 이 방법을 사용, 저희 연구실은 태아의 폐 발달과 폐 부상 mechanotransduction에 참여하는 여러 수용체 및 신호 전달 단백질을 찾아냈습니다.
프로토콜
1. ECM 단백질과 플레이트의 코팅
- 멸균 조건에서 플레이트 당 차가운 멸균 1X PBS의 12 ML과 laminin 120 μg을 섞는다.
- Bioflex 치료 접시를 타고 각 잘으로 솔루션의 2ml를 추가 (laminin의 최종 농도 2 μg / cm 2). 또는 다른 ECM 단백질 같은 콜라겐-1로서 사용될 수 [10 μg / cm 2], fibronectin [5 μg / cm 2], vitronectin [0.5 μg / cm 2]이나 엘라스틴 [10 μg / cm 2]. 코팅 기술은 그것이 laminin 코팅에 대해 설명하는 것과 비슷합니다. 우물이 완전히 솔루션이 적용되어 있는지 확인합니다.
- 플라스틱으로 번호판을 정리하고 우물의 바닥에 adsorb로 laminin을 허용하도록 하룻밤 평평한 표면에 4 ° C에 넣어. 여전히 좋은 ECM 기능을 유지하면서 이러한 조건에서는 플레이트는 최소한 1 주일 동안 저장할 수 있습니다.
- 다음날, 무균 조건 하에서, 1X PBS로 우물 3 회 씻는다.
- 는 각도에 1X PBS에 1 % BSA의 1ml를 추가하고 37 품어 세포막에서 비 특정 바인딩 사이트를 차단....
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토론
본 원고에서는 태아의 유형 II 상피 세포 및 섬유아 세포를 분리하고 Flexcell의 위기 장치를 사용하여 기계적인 자극에 노출하는 방법을 설명합니다. 우리는 상피 세포의 분화 1,2을 평가하고 수용체와 스트레치 3-9 활성화 신호 전달 경로를 연구하기 위해이 기술을 사용해 왔습니다. 또한,이 방법은 또한 기계적 손상 10,11 의해 유도된 세포 반응을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 절차는 collagenase와 폐 조직의 소화에 근거한다. 그것은 소화 후에 같이 덩어리로 2 형 세포의 경향을 이용합니다. 이 기법을 수행하는 동안 중요한 단계는 폐의 소화와 비 상피 세포의 여과를 촉진하기 때문에 2 형 세포보다 순결을 달성하기 위해 철저하게 30 15 마이크론 meshes에 비 필터링된 세포를 세척을 용이하게하기 위해 잘 조직 닦지입니다 .
우리 연구소는 m을 사용합니다embranes은 콜라겐이나 지하 점막의 E.......
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공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
NIH 교부금 HD052670 지원.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| 닭 혈청 | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| 스크린 컵 | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | |
| 시린지 필터 | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron 나일론 메시 | Small Parts, Inc. | CMN-100-D | |
| 30 micron 메시 | Small Parts, Inc. | CMN-30-D | |
| 15 micron 메시 | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma-Aldrich | V-0132 | |
| Elastin | Sigma-Aldrich | E-6402 | |
| Bioflex 플레이트 | Flexcell International | BF-3001U | 코팅되지 않음 |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
참고문헌
- Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression. Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).
- Sanchez-Esteban, J., Cicchiello, L. A., Wang, Y., Tsai, S. W., Williams, L. K., Torday, J. S., Rubin, L. P.
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