이 프로토콜 세부 대형 unilamellar 지질 vesicles로 펩타이드 translocation의 양적 측정을위한 방법입니다. 이 방법은 또한 멤브레인 translocation의 속도에 대한 정보를 제공하고 효율적이고 자발적 지질 bilayers를 건너되는 펩티드를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
쉽게 세포막 수용체 1의 도움없이 세포 세포막을 교차 펩티드에 적극적인 관심이 있습니다. 이들의 대부분은 자주 약물 전달 벡터 1-3으로 자신의 잠재력에 대해 설명되어 있습니다 세포 관통 펩티드,라고합니다. 또한, 특히 4,5 이외의 멤브레인 lytic 메커니즘, 세포 용해를 일으키는 않고 박테리아 세포막을 건너 세포내 프로세스 6,7을 방해하여 세포를 죽일 이들을 통해 작동 항균 펩티드의 증가 관심이 있습니다. 사실, 저자는 점점 더 셀 - 관통 및 항균 펩티드 1,8 사이의 관계를 지적했습니다. 멤브레인 translocation과 펩타이드 구조와 이동시키다하는 기능 사이의 관계 과정의 확실한 이해 translocation에 대한 효과적이고 재현성 assays가 필요합니다. 몇몇 그룹은 대형 unilamel로 translocation을 측정하는 방법을 제안했습니다고맙다 지질 vesicles (LUVs) 9-13. LUVs은 박테리아와 진핵 세포 점막에 대한 유용한 모델로 봉사하고 자주 펩타이드 형광 연구 14,15에 사용됩니다. 여기, 우리는 먼저 이러한 magainin 및 buforin II 16,17으로 항균 펩티드를 고려 마츠 및 동료에 의해 개발된 방법은 우리의 응용 프로그램을 설명합니다. 이 방법에 대한 우리의 프로토콜을 제공하는 것 외에도, 우리는이 분석을 사용하여 translocation 능력을 quantifies 데이터 분석에 대한 직접적인 접근 방식을 제시한다. 다른 사람에 비해이 translocation 분석의 장점은 멤브레인 translocation의 속도에 대한 정보를 제공하고 트립토판 함유 펩티드로, 펩타이드 특성 18을 변경할 수있는 형광 레이블의 추가를 필요로하지 않습니다 가능성을 가지고 있습니다. 간단히, 지질 vesicles로 translocation 능력은 기본 트립토판의 잔류물와 D 사이의 포스터 공명 에너지 전송 (걱정)의 함수로 측정단백질은 외부와 관련된 ansyl phosphatidylethanolamine은 멤브레인 (그림 1) LUV. 그들은 LUVs와 캡슐 노골적인 트립신 발생으로 휴대 관통 펩티드는 LUV 멤브레인 및 신호를 걱정의 드롭에서 disassociation로 이어지는, 죽습니다. 의 드롭 translocating 펩타이드에 대한 관찰 신호가 LUVs이 트립신 및 트립신 억제제, 또는 때 저절로 지질 세포막을 교차하지 않는 펩타이드가 트립신 함유 LUVs에 노출을 모두 포함하는 동일한 펩타이드에 대한 관찰보다 훨씬 큰 무서워. 형광에이 변경 사항은 시간이 지남에 따라 펩타이드 translocation의 직접 부량을 제공합니다.
프로토콜
1. 대형 Unilamellar 지질 Vesicles (LUVs)의 준비
- 세포막의 분석 19 싫어하지 '역할을 LUVs를 준비합니다.
- 믹스 phosphatidylcholine (POPC, 760.10 g / 몰), phosphatidylglycerol (POPG. 770.99 g / 몰), 5 dimethylaminonaphthalene - 1 - sulfonyl 50 클로로포름에 용해 phosphatidylethanolamine (DNS - 포프, 994.350 g / 몰) (아벤티 폴라 Lipids) : 45:5 비율. 모든 분석은 실험 및 제어 모두 LUVs의 별도의 준비가 필요합니다 마찬가지로 두 개의 지질 케이크 유리병을 준비한다. 총 지질 (0.188 MG POPC, 0.169 MG의 POPG, 그리고 0.019 MG DNS - 교황)의 0.376 MG는 일반적으로 하나의 translocation 시험에 대한 충분한 vesicles를 만들기 위해 충분하다.
- N 2 가스 스트림을 사용하여 클로로포름에서 증발.
- 지질 케이크에게 진공 건조기에서 9~14시간을 건조.
- 주식 10 MM의 HEPES 버퍼 솔루션 (10 MM의 HEPES, 238.3 g /....
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토론
여기에 제시 프로토콜은 내부 지질 vesicles 외부 펩티드의 농도에 상대적인 변화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 변경 사항은 translocation 능력에 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 약물 전달 벡터로서 잠재력을 지닌 세포 관통 펩티드를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 세포 관통 펩티드에 대한 흥미가 증가함에 따라, 직접 translocation 이벤트를 측정할 방법이 정량 방식으로 개발하고 사용하는 방식을 볼 수 재미있을 것입니다.
우리가 실험실에서, 우리는 분석의 일관성이 조심스럽게 실험의 몇 가지 특정 측면을 모니터링하여 향상시킬 수 것으로 나타났습니다. 첫째, 실험 및 제어 모두 vesicles의 부량이 프로토콜을 사용하여 얻은 결과의 일관성을 향상시킵니다. 이 분석은 또한 이전에 단백질 translocation과 소화의 시작 부분에 정확한 초기 형광을 감지하는 능력에 따라 달라집니다. 따라서, 그것은 fluore을 위해 필수적이며,즉시 단백질이.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자가 도움이 토론에 대한 우리 부부는 플레밍과 제시카 첸 감사하고 싶습니다. 자금은 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIH - NIAID) 수상 R15AI079685 및 연구 회사 Cottrell 대학 과학 수상에 의해 제공되었다. 추가 학생 지원은 하워드 휴즈 의학 연구소와 스탤리가 기금에 의해 제공되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| 16시에서 18시 1분까지 PG | 아벤티 폴라 Lipids | 840457C | |
| 1시 18분 Dansyl PE | 아벤티 폴라 Lipids | 810330C | |
| 16시에서 18시 1분까지 PC | 아벤티 폴라 Lipids | 850457C | |
| 돼지의 트립신 | 시그마 | T - 0303 | |
| 보먼 - Birk 트립신 / 키모 트립신 억제제 | 시그마 | T - 9777 | |
| 미니 압출기 | 아벤티 폴라 Lipids | 610,000 | |
| 암모늄 molybdate (파라) | 알파 Aesar | 10,811 | |
| L - 아스코르비 산 | 시그마 | A1417 | |
| 과산화수소, 30 % 용액 | Mallinckrodt 화학 | 5240-05 | |
| HEPES | 시그마 | H - 3375 | |
| NaCl | 시그마 | S - 9625 | |
| EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 시그마 | E5134 | |
| 아니 2 PO 4 | 시그마 | S - 0751 |
참고문헌
- Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they? Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).
- Trehin, R., Merkle, H. P. Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug....
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