다중 타겟 추적 (MTT)에 의해 플라즈마 막의 분자 확산을 매핑

Summary

다중 표적 추적은 살아있는 세포의 플라즈마 멤브레인 내에 개별적으로 분류된 분자를 추적용으로 개발된 수제 알고리즘입니다. 효율적으로 검출 nanoscale 멤브레인 역학을 조사하기 위해 사용자 친화적인, 포괄적인 도구를 제공하는 고밀도에서 시간에 따른 분자를 추정하고 추적.

Abstract

우리의 목표는 서로 다른 생물 학적 기능에 세포의 세포막에서 발생하는 분자 공정의 포괄적인 설명을 얻을 것입니다. 다중 타겟 추적 (MTT) ¹ : 우리는 고밀도로 단일 입자 추적 (SPT) 전용 분석 도구를 개발하여, 단일 분자 수준에서 복잡한 조직 및 플라즈마 막의 역학을 특성화 목표로하고 있습니다. 밀리초 및 nanometric 해상도 ^1-11을 제공하는 단일 분자 videomicroscopy은 정확하게 같은 세포 수용체의 현지화, 이동성, 감금이나 상호 작용과 같은 설명을 매핑하여 멤브레인 조직 ^12-14에 대한 상세한 표현이 가능합니다.

우리는 모두 실험적 및 algorithmically, SPT를 revisited. 실험적 측면 분자 역학 동적 스냅샷을 제공하기 위해, 최대한 라벨 밀도에 도달 특정 중심으로, 설치 및 셀 라벨을 최적화 포함의 그것은 멤브레인 내에 발생합니다. 봉우리 감지, 평가 및 재연결, 이미지 분석, ^15,16에서 특정 도구에 의해 해결 : 알고리즘 문제의 탄도를 재건에 사용되는 각 단계를 우려. 감지 후 수축을 구현하는 구조 봉우리는 초기에 인근, 강한 봉우리에 의해 숨겨져 있습니다. 참고, 탐지를 개선하는 것은 바로 궤도 내에 격차를 줄임으로써, 다시 연결 영향을 미칩니다. 공연은 일반적으로 높은 spatiotemporal 해상도에서 병렬 측정을위한 두 가지 주요 한계를 나타내는 다양한 라벨 밀도와 소음 값에 대한 몬테 칼로 시뮬레이션을 이용하여 평가되었다.

photoswitching 또는 비선형 광학에 / 오프 중 연속된을 사용하여 단일 분자를 위해 얻은 nanometric 정확도 ^17, 철저한 관찰을 제공할 수 있습니다. 이렇게 ¹⁷ 같은 스톰 ^18, 종려 ^19,20, RESOLFT ^{21 22,23을서도} 전혀 두려움을 모르는 강인한, whi 같은 nanoscopy 방법의 기초채널은 종종 이미지 고정 샘플을 요구할 수 있습니다. 중앙 작업은 단일 분자에서 냄새가 나는데 회절 - 제한된 봉우리의 탐지 및 추정이다. 따라서 이러한 브라운 운동 대신 상수 위치 정확도를 취급하는 등 적절한 가정을 제공 MTT는 straightforwardly nanoscopic 분석에 적합합니다. 또한, MTT는 근본적으로 모든 규모에서 사용할 수 있습니다 분자에 대한, 또한 세포 또는 동물만이 아니라, 예를 들면. 따라서 MTT는 분자 및 세포의 비늘에서 응용 프로그램을 발견 강력한 추적 알고리즘이다.

Protocol

이 동영상에서 우리는 특정 막 수용체를 타겟으로 양자 - 도트를 사용하여 완전한 하나의 입자 추적 실험을 제시한다. 이 실험의 주된 목표는 라이브 세포의 플라즈마 막 내에서 측정된 분자 확산 행동의 차별 다른 종류로 구성되어 있습니다. 사실, 막에서 발생하는 분자의 움직임은 일반적으로 선형적으로 감독이나 예를 들어 nanodomains ^26-29, 내에 국한 됨으로써 브라운 확산 이탈하실 수 있습니다. 우리는 살아있는 세포의 막 내에서 발생 역학에 발생하는 다양한 스냅샷을 제공하는 동시에 기술적으로 가능한 한 많은 수용체로서 다음과 같은 목표로하고 있습니다. 이것은 궁극적으로 세포 표면 수용체 신호 전달을 조절하는 메커니즘에 대해 파악하도록 기대된다.

1. 세포 배양

1. 세포 샘플을 준비 : endogenously 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) ^30을 표현 자기편 COS-7 세포를 사용합니다. 언제항생제는 준비 중에 항상 적절한 무균 기술을 사용하여 어떠한 잠재 하위 감지 오염이 없다 확실하게하지 않고도 실시간으로 세포와 협력.
2. 그들의을 가지고 돌보는 7퍼센트 CO _2와 37 ° C에서 완전한 매체 (10 % 송아지 혈청과 DMEM, 1 %의 글루타민, 1 %의 HEPES 및 1 %의 나트륨 pyruvate, 아래 특정 시약의 표 참조)에서 세포를 성장 실험실 - 테크에서 그들을 확산하기 전에 하위 합류, 지수 성장.
3. 당일 실험을하기 전에, 8 아니라 챔버 (실험실 - 테크)에서 / 잘 5,000 세포를 확산하고 밤새 품어. 세포를 계산하면 셀 당 양자 - 도트의 재현성 비율 따라서, 지속적인 세포 밀도를 보장합니다.

2. 휴대폰 라벨

특정 코팅과 양자-점들을 준비합니다. 양자-점들은 반도체로 구성된 형광 nanoparticles 있습니다. 그들은 고전에 비해 매우 밝고 photostable 때문에 이러한 nanoparticles는 높은이자를 제시단일 분자 이미징을위한 잡음 비율 (SNR)에 적절한 신호의 업적을 허용 형광 프로브 ^31,32.

1. 이전 ²¹ 설명된대로 실험을하기 전에, papain으로 소화하여, 하이 브리 도마 세포주 (mAb 108 ATCC HB-9764)에서 EGFR에 대한 팹 조각을 생산하고 있습니다.
2. 어원이 같은 말 비오틴과 팹, 제조 업체의 지침 (EZ-링크 sulfo-NHS-LC-biotinylation 키트, 써모 과학, 그림 1A).마다 있습니다.
3. 605 nm의 (세포 autofluorescence의 재능, 감지 및 분리를위한 최적의 방출 파장)에 streptavidin (Invitrogen)과 발광으로 기능화 양자 - 도트를 사용합니다.
4. 양자 - 도트 주위 현재 streptavidins뿐만 아니라 집합과 세포 및 coverslip에 비 특정 바인딩을 막기 위해이 포화하기 위해서, (특정 시약 표 참조) 완전한 매체에 라벨 솔루션을 준비합니다.
5. 두 중급 솔루션을 준비 :양자 - 도트-streptavidin과 biotinylated 팹있는 또 하나, 20 nm의 각 한.
6. 이 두 솔루션의 동등한 볼륨을 섞어 : 양자 - 도트 단지 10 nm의 팹의 최종 작업 농도를 얻기 위해 1시 1분 비율로 팹과 함께 양자-점들을 섞는다. 몰 비율을 사용 일과 다른 양자 점 하나 biotinylated 팹 조각으로 구성된 모노 작용 단지의 형성을 좋아 하시더군요. 이 수용체 ^33,34을 가교에 의한 유물의 관찰을 제한, monovalent 라벨을 좋아 하시더군요.
7. 집합을 방지하기 위해 분당 1,200 회전에 뿌리를 사용하여 25 ° C에서 15 분 동안 품어. 혼합 후 살아있는 세포에서 사용할 수 있습니다.
8. 7% CO _2와 37 ° C에서 5 분간 혼합 100 μl의 세포를 품어.
9. 비 autofluorescent 영상 매체 (HBSS 버퍼, 1 % HEPES, 특정 시약의 표 참조) 37 시에 미리 예열 ° C.로 세포를 씻어
10. 조심스럽게 취소를 방지하기 위해 레이블 초과를 제거필요가 광범위하게 영상 매체, 마지막 세탁 전에 적어도 5 분 지연으로 상온에서 일반적으로 5 회, 각 우물을 세척하여 아웃 포커스 양자-점들 때문에, 언바운드하여 SNR을 망치고있다.

3. 광학 설치

비디오 현미경 설치는 네 개의 주요 부분으로 구성되어 있습니다 :

1. 특정 형광 큐브 (FF01-457/50 여기, FF495-Di02 이색성 및 FF01-617/73 방출 필터, Semrock)과 높은 수치 조리개 (1.3 또는 1.49) 기름 침지 100x 객관적으로 거꾸로 현미경.
2. 100 W 수은 램프 (thermoregulation 방해를 피하기 위해, 광섬유를 통해 현미경으로 결합).
3. 512 X 512 픽셀 고감도는 충분한 SNR을 달성하기 위해 카메라를 EMCCD.
4. 실험 기간 동안 37 ° C에서 생물 학적 샘플을 유지하는 인큐베이터.

4. 취득

1. 절연과 잘 확산 셀을 선택합니다. 이최고의 멤브레인 분자의 평면 운동을 찾도록 적응 좋은, 평면 lamellipodia의 확장자를 선호한다.
2. 전송된 광과 형광의 양쪽 모양으로 세포 생리 상태를 평가 : 강렬한 기공을 갖는 트래픽, 괴사성 또는 apoptotic 표지판, 낮은 autofluorescence, 평균 - 강력한 양자 - 도트 라벨링 (일반적으로 셀 당 최대 1,000 양자 - 도트 부재가 확인 그림. 1B, C).
3. 동시에 가능한 한 많은 수용체를 감시하는 중요 높은 라벨 밀도를 선택합니다. 이것은 실제로 모두에 의해 생리 (표면 표현, 에피토프 접근, 수평 운동)과 알고리즘 매개 변수 (비 중복 포인트 확산 함수 (PSF), 심지어 적절한 감지 및 다시 연결을 허용하도록, 운동으로 인한 계정 흐리게 고려). 제한됩니다
4. 각 셀에 들어, 먼저 추가 세포 측면에 대해 확인할 수 있습니다 brightfield 필드 이미지를 (가능한 경우 우선적, DIC 사용) 취득그리고 lamellipodia의 공간적 한계.
5. 이러한 규칙과 함께, 이후 DIC라는 하위 폴더에, 비디오 스택 (예 : 예를 들어 cell1.tif & cell1.stk 등)와 같은 이름을 사용하여이 이미지를 저장, 알고리즘은 자동으로 매칭되는 이미지를 다시 찾을 수 각 스택.
6. 일반적으로 36-MS 율이 카메라로 풀 프레임에 도달하는 가장 빠른 속도로 지속적으로, 세포 당 1-3 비디오를 습득. 하지만 하나는 증가 감도 및 / 또는 더 적은 픽셀로 전용 CCD를 이용하여 최대 1-MS 속도로, 더 높은 주파수에서 수집할 수 있습니다. 프레임 전송 기술은 프레임 사이의 무시할 지연을 제공합니다.
7. 전자 번식 강화는 항상 최소 20 DB (효율적인 피크 검출 ¹⁾ 위, 충분한 SNR과 함께 일반적으로 주변 25~30dB을 단일 분자 감도를 달성하도록 최대 (단 채도 아래 관련되는 경우)로 설정되어야합니다.
8. 일반적으로 비디오, 죄 300 프레임을 습득CE의 탄도는 주로 긴 점멸 이벤트에 의해 제한 평균 ~ 100 프레임 이상 복원됩니다. 비디오 주파수와 길이는 인스턴스에 대한 긴 흔적을 요구할 수 주어진 측정 방식에 맞게 조정 할 수 있습니다.

5. MTT 분석

1. Matlab 또는 옥타브와 특정 데이터 집합을 평가하기 위해 비디오 파일이있는 디렉토리의 경로를 선택합니다.
2. 완전히 automatized 분석 ^1,35를 시작하려면 Matlab에서 옥타브, 또는 MTT23i에서 명령 detect_reconnex23을 입력합니다. 이 프로그램은 "사용자 인터페이스, 버전 2.3"를 나타내며 2.2 이전 버전과 함께 다운로드할 수 있습니다. 그림에서와 같이 먼저 사용되는 모든 매개 변수를 나열하는 그래픽 인터페이스를 표시합니다. 2.

6. 대표 결과

MTT가 자동으로 추가하여 보완 감지하고 예측 대상의 흔적을 전달하기 위해, 각 레코더의 비디오를 분석이러한 감금 검출 등 vestigations. 이것은 궁극적으로 세포 이미지 (그림 1C 및 3)을 통해 매핑 흔적이 있습니다.

MTT 설명

핵심 MTT 분석은 3 가지 주요 작업을 (그림 3) 호출, 각각의 프레임을 통해 수행됩니다 :

1. 슬라이딩이 가설은 비교 연속 각 픽셀 중심으로 하위 지역 내의 대상 (양자 점)의 존재 또는 부재가 탐지 : PSF로 존재하거나 신호는 이중 차원 가우스 피크로 modelized , 또는 프레임마다 미만 가짜 검출로, 낮은만큼 거짓 경보를 할려고 임계값을 사용하여 전용 소음. 이것은 탐지 확률의지도로 안내합니다. 각 지역 최대의 확률 수준이 잘못된 경보 (PFA)의 원하는 확률에 따라 설정된 최소 값보다 높으 않도록 할려고, putative 대상으로 간주됩니다. 이 제한은 효율적 시그마를 차별 정도로 낮게 설정됩니다소음으로부터 nals 여전히 감지 충분히 높은 확률을 허용하면서 이론적으로 예측된 최적의 ^1에 도달, 최고의 가짜 탐지 (기본 10 ^-6의 PFA, 512 X 512 픽셀의 이미지 미만 오류 확보)에서 피하는. 하위 영역을 사용하는 요구가 이미지 테두리 (7 X 7 픽셀의 기본 창 3 픽셀), 평가할 수 없다는 것을 의미합니다.
2. 이러한 서브 픽셀 위치 및 신호 강도 등 관련 매개 변수, 각각의 감지 대상에 대한 추정. 모든 검색 대상의 경우 최소 제곱 가우스 - 뉴튼의 끼워 맞춤은 다음 감지된 가우스의 위치, 너비 및 높이를 추정하기 위해 수행됩니다. 이것은 특히 염료의 하위 픽셀 위치 (일반적으로 SNR 값 및 움직이기 힘드는 또는 느리게 diffusing 염료 위해 10-20 nm의 정확도, 0.1 μm의 ² / s의 diffusing 염료에 대해 ~ 100 nm의 최대 증가)을 제공합니다.
3. 와 새로운 목표의 다시 연결흔적은 이미 이전의 프레임 위에 지어진. 새로운 목표의 집합은 이전의 흔적을 세트로 일치합니다. 이 목적을 위해, 추적 각 목표를 할당하는 순서에 따라 가능하면 감지 단계에서 얻은 가능한 모든 통계 정보가 자세뿐만 아니라, 사용, 또한 강도, 폭, 점멸 및 관련 통계가있다. 따라서 목표는 바로 가장 가까운 성분에 할당되지 않습니다 건너 흔적, 강도, 속도, 폭 및 점멸의 경우에는 간주됩니다. 이것은 통계적으로 최적 다시 연결 점수를 제공합니다. 가장 가까운 이웃으로 다시 연결을 바이어스 가능한 경우,이 전략은 방지됩니다.

탐지된 봉우리들은 추정 또는 재연결에 실패할 경우 거부 후천 될 수 있습니다. 특별 검사는 새로운 트레이스를 시작 것이 새로운 봉우리의 감지를 처리​​합니다. 이 테스트는 더 엄격한 PFA (10 ^-7)을 사용하여 추적 (Trace)에 피크를 다시 연결 이후 유효성 O로 사실상 해석될 수 F의 관련성 (이 기준은 새로운 봉우리에 대해 적용되지 정의가되는).

탄도 분석

가능한 과도 감금은 다음 반대 지역 확산 ^24-29에 관련된 함수에 의해 평가됩니다. 임계값을 적용하는 것은 에피소드를 협소한 정의하거나 않을 수 있습니다. 모든 추적을 통해 이들을 iterating함으로써 우리는 과도 감금 측면에서 / 이벤트를 느리게, 멤브레인 역학을 매핑할 수 있습니다. 이것은 또한 바이너리 또는 감금 지수의 이산 값 중 하나를 사용하여 표현할 수 있습니다.

기본적으로 MTT는 자동으로 텍스트 파일에 8 피크 매개 변수를 저장, 이러한 작업을 수행합니다 프레임 번호, I 및 J 위치, 신호 강도, 반경, 오프셋과 각 비디오 프레임 (7 행 그룹)과 추적 (열)에 대해 깜박 . 에 exemplified으로 이러한 출력 매개 변수, Matlab 또는 옥타브 더 즉 흔적이나 신호 강도를 분석하는 fread_data_spt 스크립트를 사용하여 다시로드 수 부록의 "https://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt"> MTT_example 스크립트.

더 자세한 분석은 각 셀 위에 흔적을 매핑 (그림 1C & 3)와 관련 매개 변수 (예 : 피크 농도, SNR 또는 현지 확산 값 등)에 대한 히스토그램 분포를 제공하기 위해 이어진다. 각 파일의 내용은 의미와 각 매개 변수의 표준 편차는 histograms의 이미지와 함께 텍스트 파일에 저장됩니다. 이러한 R ² 제곱 변위에 대한 로그와 같은 배포판은 기하 평균을 초래할. 확산 계수 D가 엠에스디 곡선의 다섯 가지 첫째 점 이상 선형 발작으로 계산됩니다. 이 값은 세포 반응이나 막 조직에 영향을 미치는 제약 / 효소 치료의 예를 들어 운동을 위해 관련된 실험의 개요를 제공합니다. MTT는 오픈 소스 코드이므로,이 부분은 쉽게 어떤 헌신적인 수사에 적응 수 있습니다.

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1 그림. MTT에 의해 막 수용체 역학을 모니터링. 같은 EGFR과 같은 () 멤브레인 컴포넌트,,하고 biotinylated 팹 조각 (각 분자의 약 올바른 스케일링과 설계도를 그리기)에 결합 양자-점들을 적었. (B) 일반 형광 이미지는 개별적으로 표시된 수용체에 대응하는 회절 - 제한된 봉우리를 묘사, 36-MS의 노출 시간과 함께, 살아있는 COS-7 세포에서 인수했습니다. (C) MTT 분석의 출력 셀의 brightfield 이미지에 중첩 수용체의 재구성 궤도를 표시.

그림 2. MTT 입력 매개 변수. MTT23i를 실행하면 같은 우리의 이전 게시물 ^1에서 설명한 모든 입력 매개 변수 이름과 기본값을 나열하는 그래픽 사용자 인터페이스를 엽니다. 알고리즘, 공간 및 시간 매개 변수 (검색 창, 최대 반경, 최대 확산에 그리고 점멸) 무차 표준 단위, 픽셀 및 프레임에 있습니다. 교정은 출력 결과를 변환하는 후천을 적용할 수 있습니다. 156 nm의 / pxl 및 프레임 지연 : : 36 MS / 프레임 100x 배율과 캐스케이드 512BFT에 해당하는 기본값은 픽셀 크기입니다.

수사관은 최대 기대 확산 계수 ( "비교 최대")과 최대 점멸 실종 ( "T _OFF")와 같은 몇 가지 중요한 매개 변수를 최적화해야합니다. 이 두 공간과 시간 제한은 거의 주어진 실험 조건을 위해, 다른 사람은 강력한 기본값으로 설정되고 재고할 필요가 있거든요. 예를 들어, 잘못된 경보의 수를 직접 대부분의 경우 만족 프레임 당 하나 이상의 따라서 더 적은 백만 픽셀 당 미만 오류를 보장하기 위해 설정됩니다. 모든 매개 변수는 사용자가 분석에 사용되었다 어떤 설정을 나중에 확인할 수 있도록 출력 폴더의 텍스트 파일에 저장됩니다.

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그림 3. MTT 분석의 주요 단계. 형광 이미지의 실험 스택에서 시작은 봉우리가 순차적으로 그리고 자동으로 감지 가우스 발작 및 프레임 이상 다시 연결 (작업의 첫 번째 범위, 순서도의 위쪽 부분)에 의해 추정된다. 자국이 더욱 궁극적으로 관련 설명 (운영 초 범위, 낮은 부분)의 역동적인지도로 이어지는 예를 들어, putative 감금에 대해 분석할 수 있습니다.

4 그림. 상표 원자는 MTT에 영향을주지 않습니다. artefactual multivalent 라벨에 의해 도입된 가능한 편견을 평가하기 위해 MTT 분석은 궤도의지도를 생성하고 분석, 2 개의 서로 다른 스키마를 사용하여 태그를 내생 EGFR을 추적하기 위해 수행되었다. 프로토콜의 설명에 따라 (A) 수용체는 biotinylated 팹 및 양자-dots605-streptavidin 태그가되었다.이 경우에는 양자 - 도트와 streptavidins의 다중 결합은 단일 염료로 여러 수용체에 결합이 생길 수 있습니다. (B) 수용체를 직접 유기 염료, Atto647N에 결합 팹 태그가되었다. 이 경우 하나의 팹, 따라서 한 수용체는 두 개 이상의 염료를 결합 수 있습니다. (C) 평방 변위 (MSD) 곡선은 양자 점이나 Atto 염료 (왼쪽 및 오른쪽 그래프, 각각)로 중 분류, 각 세포의 모든 성분에 대해 계산되었습니다 평균입​​니다. 확산 계수는 엠에스디 (빨간 점선)의 다섯 가지 첫째 점 이상의 선형 발작에 의해 계산되었다. 유사한 확산 값 (중앙 그래프)로 이끌어 레이블링 각각의 구조. Qdot : 양자-dots605 (n은 = 5 셀), Atto : Atto647N (N = 7 셀), NS :하지 상당 (학생의 T-테스트 P 값> 0.05).

Discussion

단일 입자 추적에서 세포와 현미경 측면 옆에, 분석 작업의 상당한 부분을 나타냅니다. , 검출 추정하고 각 프레임 이상의 봉우리를 다시 연결 : 이것은 세 가지 주요 작업을 수행하는 데 사용되는 알고리즘을 해결합니다. 그러나이 작품의 결과의 양상은 마지막 여분의 단계 (예 : 운동 모드, 상호 작용 또는 stoichiometry를 해독 등)에 대한 본질적으로 새로운 헌신 조사를 위해 적응해야 할 수도 알고리즘 자체를 elaborating에 있습니다.

하지만 일단 알고리즘은 완전히 우리가 최소 (그림 3)에서 입력 매개 변수의 수를 유지에 신경을 쓰지 특히 이후 개발은 간단합니다 실행됩니다. 이것은 MTT 매우 강력하고 쉽게 구현할 수 렌더링. MTT를 elaborating 때, 우리는 전적으로 각 작업에 사용되는 분석 옵션을 다시 생각해 목표로. 우리는 두 개의 도전 축을 따라 프로세스를 최적화하고 싶었 :

1. 지혜를 다루는라...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약	회사	카탈로그 번호	양
있으니까요-7 세포주	ATCC	CRL-1651	5,000 세포 /도
칼슘이없는 HBSS +	GIBCO	14,175	한 ML
0.05 % 트립신 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)	GIBCO	25,300	한 ML
실험실 - 테크 8도	NUNC	155,441	일
QDot-605 streptavidin	Invitrogen	Q10101MP	20 MM
Biotinylated 팹 (팹 합성을 위해, 참고 21 참조)
mAb 108의 팹	ATCC	HB-9764	200 μg
보건국-비오틴	써모 과학	21,435	18.5 μg
매체를 완료
DMEM	GIBCO	41,965	500 ML
태아 소 혈청	시그마	F7524	50 ML
L-글루타민	GIBCO	25,030	5 ML
HEPES	GIBCO	15,630	5 ML
나트륨 Pyruvate	GIBCO	11,360	5 ML
이미징 매체
칼슘 2 HBSS +	GIBCO	14,025	25 ML
HEPES	GIBCO	15,630	250 μl