방법 논문

DNA 손상 감지를위한 세미 인공 분자 기계 및 이용 체외 조립에

DOI:

10.3791/3628

⸱

2012년 1월 11일

 , 
1Neurosurgery, Baylor College of Medicine , 2Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 3Molecular & Cellular Biology, Baylor College of Medicine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 topoisomerase 단백질에 의해 구동되는 분자 규모의 장치의 조립 및 응용 프로그램을 보여줍니다. 구조는 끝이 두 가지 다른 fluorophores을 첨부하여 조직 섹션에서 DNA 나누기의 두 가지 주요 유형의 레이블 생체 분자 센서이다.

초록

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자연스럽게 발생하는 생체 분자 기계는 모든 살아있는 세포에서 작업과 디자인 1-6 다양한 표시됩니다. 그러나 방향 운동, 즉 분자 모터 수있는 장치에 대한, 그들의 스케일 다운 기계 부품 (바퀴, axels, 펜던트 등) 7-9에서 인공 분자 기계 센터의 개발. 이것은 관성과 운동량 보존 이러한 장치에 대한 필수적인 물리적 속성, nanoworld 환경 10 사용할 수없는 경우에도 매크로 시스템을 imitates. 기계 macromachines 계획에 따라 생물 학적 분자의 진화에 개발한 메커니즘을 사용하지 않는 대체 디자인, nanoworld의 특정 조건을 활용할 수 있습니다. 게다가, 나노 디자인의 목적을 위해 실제 생물 학적 분자를 채택하면 나노 제품 포즈 수있는 잠재적인 위험을 줄여줍니다. 여기는, 하나의 바이오 기반 구조의 조립 및 애플 리케이션을 설명인공 구성 요소와 자연 - 발생 분자 기계를 결합하여 EMI - 인공 분자 장치. 보기의 enzymology 지점에서, 우리의 구조는 디자이너 형광 효소 - 기질 복합 특정 유용한 기능을 수행하기 위해 함께 들어가게된다. 그 하나의 12가 들어 있으므로이 어셈블리는 정의에 의해 분자 기계입니다. 그러나, 설계 부분와의 통합 - 형광 듀얼 머리 핀의 자형 - DNA 손상 12 라벨링의 새로운 작업에 다시 번 지휘하고 있습니다.

우리의 구조는 32 메르 DNA와 효소 우두 topoisomerase I (VACC TOPO)의 밖으로 조립. 기계 후 두 찬란 표시 검출기 단위 (그림 1)를 조작하기 위해 자신의 소재를 사용합니다. 단위 중 하나는 (녹색 형광) covalently의 3'end와 다른 장치 (적색 형광)에 연결된 VACC TOPO가 터미널 3'OH와 함께 무료로 머리핀입니다시킵니다. 단위도 잊혀하고 신속 이후 recleaves 원래 구조로 다시 재조 립.DNA의 부재에서는 순환 방식으로 연속적으로 분리하여 religate이 두 단위 나옵니다. DNA 손상, topoisomerase 운반 검출기 단위 선택 찬란를 라벨, 5'OH (DNase II 타입 나누기) 11,12과 무딘 엔드의 DNA 휴식에 부착과 조직 섹션에. T4 DNA ligase에이 솔루션 13,14에있는 경우 oligonucleotide 절단 후 형성 둘째, 효소 - 무료 머리핀은 5'PO 4 무딘 엔드 휴식 (DNase I - 타입 휴식) 11,12에 ligate 것입니다. T4 DNA ligase의가 조직의 섹션 또는 5'PO 4 무딘 엔드 휴식과 DNA를 포함하는 솔루션에 추가되면, ligase 준 안정 효소 - DNA의 단지를 형성, 5'PO 네 DNA 종료와 함께 반응. 무딘 종료된 헤어핀 따라서 5'PO 4 무딘 엔드의 DNA 나누기를 라벨, DNA에 ligase와 covalently 연결 헤어핀를 방출이 단지와 상호 작용합니다.

이 개발 일에 새로운 실용적인 접근 방식을 exemplifies전자 분자 기계의 설계 및 고정 세포 및 조직에서 apoptosis와 DNA 손상의 검출에 유용한 센서를 제공합니다.

프로토콜

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자신의 준비는 분자 장치의 조립보다 더 많은 시간을 소요하기 때문에 분자 기계 기반의 탐지에 대한 부분 먼저 준비되어야합니다. 구조는 paraformaldehyde - 고정, 파라핀 - 임베디드 조직 블록에서 컷 5 6μm 두께 부분과 잘 작동합니다. 이러한 ProbeOn 플러스 충전 및 precleaned 슬라이드 (피셔 과학) 또는 유사한뿐만 아니라 섹션을 유지 슬라이드 브랜드를 사용합니다. 우리는 최초의 dexamethasone - apoptotic 취급 쥐 thymus 13,14으로 DNase I -와 DNase II 타입 휴식을 모두 포함하고 DNA 손상의 잘 알려진 패턴을 가진 조직을 이용하여하는 것이 좋습니다.

1. 섹션의 준비

  1. 15 분 크실렌의 슬라이드 랙 및 dewax의 섹션을 장소, 추가 5 분 신선한 크실렌 욕조에 전송할 수 있습니다.
  2. 등급 에탄올 농도 통과하여 Rehydrate : 96% 에탄올 2x5min, 80 % 에탄올 - 5 분​​, 물 - 2x5 분.
  3. Proteinas과 다이제스트 섹션전자 K. 섹션 당 50μg/mL 솔루션의 100μL를 사용하십시오. humidified 챔버의 실내 온도 (23 ° C)에서 품어 15. 시간은 조직 유형에 따라 조정해야 할 수도 있습니다. 하드 조직은 더 이상 소화가 필요 할 수도 있습니다. 15-25 분 시간은 일반적으로 사용됩니다. 부족 소화가 약한 신호가 발생할 수 있습니다. 신호 실종 및 섹션 파괴에 반대 결과에 Overdigestion.
  4. 2x10 분 증류수로 씻어.
  5. preblocking에 대한 2 % BSA 100 μL 당 섹션을 적용합니다. 상온에서 15 분 (23 ° C)를 품어. 이 시간 동안 분자 기계를 조립.

2. 분자 기계 조립

모든 시약은 평균 크기의 조직과 (10x10mm)에서 하나의 검출에 충분한 25 μL 총 볼륨에 대한 결정됩니다. 필요에 따라 볼륨이 최대 크기를 조정하실 수 있습니다.

  1. 이 순서에서 작은 플라스틱 튜브의 통합 :
  1. Bidistilled 물;
  2. 15 % 폴리에틸렌 글리콜 - 8000;
  3. 66 솔루션 MM - 트리스 HCL, pH를 7.5, 5 밀리미터 MgCl 2, 0.1 MM dithioerythritol, 1 ㎜ ATP (즉, 정기적으로 T4 DNA ligase의 버퍼);
  4. Oligonucleotide 일 70 pmoles,
  5. 215 pmoles (1.76-7.1 μg) VACC TOPO
  6. 10 대 T4 DNA ligase (500 U / ML)
  1. pipetting으로 조심스럽게 섞는다. 분자는이 솔루션에서 즉시 자기 조립 구조 실내 온도 (23 ° C)에서 즉시 사용할 수 있습니다. 37 온도를 증가 ° C 블록 라벨의 T4 DNA ligase 기반 구성 요소입니다.

3. 이중 레이블 5'OH 및 5'PO4 DNA의 휴식 시간에 조직 섹션에서 분자 기계를 사용하여

  1. preblocking 솔루션을 기음과 Oligonucleotide 일 70 pmoles, 53 포함 전체 반응 믹스의 25μL 적용 - 215 pmoles (1.76-7.1 μg) VACC를66 MM - 트리스 HCL, 산도 7.5, 5mM MgCl 2, 0.1 MM dithioerythritol, 1 ㎜ ATP, 그리고 15 % 폴리에틸렌 글리콜 - 8000의 솔루션 TOPO 10 대 T4 DNA ligase (500 U / ML). 단일 FITC 라벨 Oligonucleotide 2 나르는 동일한 시퀀스 oligonucleotide는 DNA 나누기의 단일 유형의 탐지를 위해 대신 사용할 수 있습니다. 이러한 경우에는 상표 반응에서 ligase를 생략하면됩니다. 또한 이런 상황에서 50mM 트리스 - HCL, 산도 7.4의 솔루션 15 % PEG - 8000는 T4 DNA ligase의 버퍼 대신 사용할 수 있습니다.
  2. 플라스틱 coverslip와 humidified 챔버의 실내 온도 (23 ° C)에서 1 시간을위한 품어. 빛과 보호합니다. 16의 온도를 낮추는 ° C의 ligase 기반의 신호를 감소, 37의 온도 증가 ° C 완전히 ligase 기반의 신호를 제거합니다. ligase의 부분 억제 때로는 topoisomerase의 준비를 도입 오염 물질로 인해 가능, 반응 혼합물에 발생합니다. 따라서, 더 이상 부화 (2~4시간)이 필요 수도 있습니다 특히의ligase - 라벨 쉬는 ignificant 번호는 존재한다. ligase 및 topo 신호 모두 많은 경우,이 단계에서 관찰 될 수 있지만 ligase 신호 VACC TOPO 및 듀얼 표시된 Oligonucleotide없이 반응 믹스의 다시 응용 프로그램에 의해 더욱 강화된 수 있지만 머리핀 모양의 oligonucleotide (Oligonucleotide 3)이 포함된 수 (35 MG / ML)와 T4 DNA ligase (250 U / ML). 향상시키기 위해 신호는 5 단계로 이동하십시오 개선하지 않고 반응을 보려면, 3 단계로 진행합니다.
  3. 부드럽게 실온에서 물을 포함하는 Coplin 항아리에 세로 슬라이드를 immersing하여 coverslips를 제거합니다. 초과 물을 기음.
  4. VACC TOPO와 Oligonucleotide 일없이 반응 믹스 25 μL을 적용하지만, Oligonucleotide 세를 포함하여 ligase 신호를 강화 : 66 MM - 트리스 HCL, pH를 7.5, 5 밀리미터 MgCl 2, 0.1 MM dithioerythritol, 1 ㎜ ATP, 그리고 15 % 폴리에틸렌 글리콜 - 8000, 5 대 T4 DNA ligase 35 MG / ML Oligonucleotide 3 (무딘 머리 핀의 자형으로 종료). 라벨 솔루션 CA의 총 부피N은 큰 섹션을 수용까지 확장할 수 있습니다. 플라스틱 coverslip와 humidified 챔버의 실내 온도 (23 ° C) 18 HR (야간)를 품어.
  5. 부드럽게 실온에서 물을 포함 Coplin 항아리에 세로 슬라이드를 immersing하여 coverslips를 제거합니다. 다음 증류수 섹션 3x10 분 씻으십시오.
  6. 나트륨 중탄산염 버퍼와 린스. 알카라인 솔루션은 산도 민감하고 상당히 산도 7 아래의 감소 FITC 형광을 향상 린스.
  7. antifading 솔루션 (DAPI로 Vectashield), coverslip와 부분을 커버하고 형광 현미경을 사용하여 신호를 분석할 수 있습니다. 5'OH로 두 번 스트랜드의 DNA 휴식 시간은 녹색, 5'PO 4 나누기를 형광 빛이 나겠 - 레드 (그림 2) 형광합니다.

4. 대표 결과

figure-protocol-1
그림 1. 세미 인공 분자 기계는 다음 두 가지 유형의를 감지현장에서 DNA 손상. VACC TOPO는 이중 머리핀 32 메르에 바인딩하면 형광 기계 자체 - 조립. 기계를 통해 두 검출기 단위로 분할 자체로 작업을 시작 topoisomerase 만들어진 인식 순서의 3 '끝에 했네요. FITC - 레이블이 붙은 장치가 지속적으로 분리와 rhodamine - 레이블 단위로 religates 순환 과정에서이 결과를. 감지 DNA 브레이크가 발생되기 전까지이 지속. 이러한 대안 수용체 (5'OH 뭉툭한 끝 DNA 휴식) 조직 섹션에있는 경우, FITC 부분은 그것을 ligate 것입니다. 나머지 rhodamine 부분은 T4 DNA ligase의의 도움으로 5 'PO 4 DNA 뭉툭한 끝 휴식에 연결합니다. 따라서 DNA 나누기 두 가지 유형의 동시에 감지됩니다.

figure-protocol-2

그림 2. 분자 기계 이중 라벨 DNA 나누기 두 종류의dexamethasone - 처리 thymus의 조직 섹션 인치 DNase의 무딘 엔드 DNA의 휴식 시간은 I -와 DNase II - 타입은 apoptosis를 겪고 thymic 피질 영역에서 감지됩니다. 녹색 형광 세포질 (5'OH DNA 나누기)은 apoptotic thymocytes의 핵 물질을 소화 외피 macrophages을 표시합니다. 이 신호는 VACC TOPO에 의해 생산, 그리고 5'OH 더블 스트랜드 휴식 11,12를 포함하는 DNA와 phagolysosomes에 localizes 있습니다. 적색 형광 (5'PO 4 나누기) macrophages에 의해 빨아들이는하지 apoptotic thymocytes의 레이블 핵. thymocytes의 거대한 숫자가 동시에, 5'PO 4 번 스트랜드 나누기의 생성과 함께 apoptosis를 받아야 ligase 기반의 라벨로 시각. 이러한 휴식은 고리 모양의 패턴을 형성, 핵 주변에 위치하고 있습니다. 모든 세포의 핵은 DAPI (파란색 형광)과 counterstaining에 의해 시각입니다.

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토론

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이 비디오에서는, 우리는 이중 라벨의 DNA 손상 센서를 조립하고 사용하는 방법을 보여줍니다. 센서는 생체 분자 엔진, 인공 구성 요소와 연결된 바이러스 인코딩된 단백질 VACC의 TOPO에 의한 분자 기계입니다. 표시 개발 무독성 분자 규모의 장치 12,15의 디자인에 생물 학적 구조, 아키텍쳐 및 세포의 실제 부품과 구성 요소를 채택 옹호 생체 활성화된 접근 방식을 exemplifies. 1 :이 방법은 생체내의 nanosensors의 분야에 내재된 두 가지 문제를 해결합니다. 전통 nanomaterials를 사용하여 나노 구조 정말 균일하고 재현성 만드는 어려움 및 2. 잠재적인 독성 및 나노 프로브, 입자 및 기타 고도로 분산된 nanomaterials의 높은 생물 학적 반응. 센서는 DNA 손상 라벨의 새로운 기능에 다시 직접 인공 구성 요소와 자연 - 발생 분자 기계를 통합합니다. 이러한 통합 제품은 SE입니다MI - 인공 분자 기계는 새 작업을 타겟으로. topoisomerase...

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공개 사항

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

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이 연구는 국립 신경 장애 연구소 및 행정, 건강의 국립 연구소 (VVD)로부터 신경 장애 및 뇌졸중, 국민 ARRA를 통해 보건 연구소 (VVD)과 R21의 국립 연구소에서 R21 NS064403 부여하여 부여 R01NS062842에 의해 지원되었다 바이오 메디컬 이미징 및 생물의 EB006301 국립 연구소, 건강 (VVD)의 국립 연구소.

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재료

  1. 크실렌
  2. 80 96 % 에탄올.
  3. 증류수에 (BSA) 소 혈청 알부민의 2 % 솔루션입니다.
  4. Oligonucleotide 1 : 이중 머리핀, 이중이 플루오레신 및 tetramethylrhodamine으로 표시 :

GCG AT 5' - AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT는 R TT - 3 '; F - FITC - DT, R - Tetramethylrhodamine - DT. 이러한 BODIPY TR, rhodamine 또는 TAMRA 같은 다른 빨간 이동 fluorophores은 R 대신 tetramethylrhodamine에 사용할 수 있습니다.

또는 당신은 Oligonucleotide 2 사용할 수 있습니다 -. 플루오레신으로 표시 더블 머리 핀의 자형으로 단일 (DNA 나누기의 하나의 유형 (DNase II 타입 전용)의 검출을위한 단일 형광단 운반 탐사선이 상당히 저렴하고 편리한 때마다 단일 DNA 나누기의 유형은 표시되어야하는 것입니다 : 5' - AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T - 3 '; F - FITC - DT

  1. Oligonucleotide 3. Tetramethylrhodamine - DT - R, 5' - GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC - 3 'T4 DNA ligase와 함께 현장의 결합 신호에의 향상을 위해 무딘 엔드 rhodamine - 라벨이 머리핀
  2. 우두 DNA topoisomerase L (VACC TOPO) - 3,000 U / μL (생생한 기술). 초기 실험에서 우리는 반응 믹스의 모든 25 μL 당 VACC TOPO의 215 pmoles (7.1 μg)를 사용합니다. 그러나, topoisomerase 농도는 상당히 감성의 손실없이 줄일 수 있습니다. 우리는 나중에 유사한 결과를 섹션당 VACC TOPO (섹션당 반응 믹스 25 μL의 1.76 μg)의 4 배 낮은 금액을 사용합니다. 880 NG (반응 믹스 25 μL)로 효소의 양을 줄이는 것은 약한 신호와 VACC TOPO의 8.8 NG 결과는 감지 신호를 생산하지 않습니다.
  3. T4 DNA ligase 5 U / μL (Roche는). 이 고도로 집중 ligase 준비 우리가 실험 조건에서 최고의 신호를 제공합니다.
  4. T4 DNA ligase 10 X 반응 버퍼 : 660 MM 트리스 - HCL, 50 MM MgCl 2, 10 MM의 dithioerythritol, 10 MM ATP, 산도 7.5 (20 ° C) (Roche는). 반응 버퍼 ATP는 쉽게 해동 - 냉동의 반복 사이클에서 파괴됩니다. 나누어지는는 다음 위치에서 작은 15-20 μL 부분과 저장소에있는 버퍼 - 20 ° C. 한번 사용합니다.
  5. bidistilled 물에 PEG - 8000 (시그마)의 30 % (W / V)이 솔루션입니다. 15% 반응 믹스에서 PEG - 8000 강력하게 볼륨 제외하여 성분의 효과적인 농도를 증가, 검색을 자극.
  6. 증류수의 Proteinase K (Roche는) 20 밀리그램 / ML 재고 솔루션입니다. 에 저장 - 주식에서 준비 PBS의 반응을 사용 50mg/mL 솔루션, 20 ° C.. 재사용하지 마십시오.
  7. DAPI (벡터 연구소)와 Vectashield.
  8. 나트륨 중탄산염 버퍼 : 50m M NaHCO 3, 15m M NaCl, pH를 8.2.
  9. 22x22mm 또는 22x40mm 유리 또는 플라스틱 coverslips. 플라스틱 coverslips들은 같은 반응 동안 좋습니다 아르섹션에서 제거할 쉽게 다시.

참고문헌

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