여기 마우스 tracheas의 기초 및 submucosal 글 랜드 덕트 세포의 분리에 대한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 또한을 만들 등쪽 마우스 지방 패드에 줄기 세포를 주입하는 방법을 보여줍니다 생체 내 모델입니다.
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이 논문에서
요약
초록
대형 항공은 1 우리가 숨 독소와 전염성 대리인의 부상 때문에 민감 환경과의 접촉에 직접하고. 대형 항공 따라서 효율적인 복구 메커니즘이 우리 몸을 보호하기 위해 필요합니다. 이 복구 과정은기도의 줄기 세포에서 발생기도에서 이러한 줄기 세포를 분리하는 것은 수리와 중생의 메커니즘을 이해하는 것이 중요합니다. 이기도 질환이 될 수 있습니다 이상 수리를 이해하는 것도 중요하다. 이 방법의 목적은 마우스 tracheal submucosal 글 랜드 덕트에서 새로운 줄기 세포 인구를 분리하고 submucosal 선들은 3 수리와 중생의 메커니즘을 식별하는 체외 및 생체 모델 시스템에서 이러한 셀을 배치하는 것입니다. 이 생산은 큰기도 3에서 덕트 및 기초 줄기 세포를 분리하고 분석하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.이 우리에게 수이러한 낭성 섬유증, 천식, 만성 폐 질환으로 방해하는기도가 질병을 공부합니다. 현재 submucosal 선 덕트 세포의 분리에 대한 방법은 없습니다 및 submucosal 분비의 재생을 연구하는 생체 모델에 더 있습니다.
프로토콜
단계의 개요
1. 기관의 해부
2. 호흡 관을 청소하고 절단
3. 하나의 세포 현탁액에 효소 소화 및 처리
4. FACS에 얼룩 및 정렬
5. 생체 및 체외 모델에 대한 분류 세포를 처리
1. 기관의 해부
- pentobarbital 0.1 mg/0.2 CC의 intraperitoneal 주사와 마우스를 안락사시켜야.
- 복부 벽을 열고 잘라 내고 복부 대동맥을 노출 한 다음 해부하기 위해 옆에 창자를 이동합니다.
- 심장과 폐를 노출 양쪽 횡격막과 흉부 앞쪽에 벽을 통해 절단하여 상자를 엽니 다. 기관을 폭로하기 위해 지방과 침샘을 제거 목에까지 절단 계속합니다.
- thymus를 제거하고 아래의 뒤의 연결 해제 폐를 잘라. Separ그들 사이 집게를 삽입하여 식도에서기도를 먹었다는 후두와의 연결을 위의 상단 대부분의 기관을 잘라. 그런 다음 집게로 기관을 보유하고 첨부 파일에서 해부하고 마음과 폐 전용 블록으로 ....
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토론
기도의 덕트와 기저 세포를 분리하는이 기술은기도 수리 및 재생과기도 질환에 대한 우리의 이해를 개선하는 것이 중요합니다. 여기에 설명 된 기술은 몇 가지 중요한 단계가 포함되어 있습니다. 첫 번째는 최적화 된 효소 소화 기간입니다. 두 번째는 세포 전단을 방지하기 위해하지만, 셀 clumps을 깨고 점점 더 게이지 바늘로 passaging 시리얼을 통해 단일 세포 현탁액의 창조입니다. 세 번째는 FACS 분석 및 적절한 항체와 세포의 게이팅입니다.
ITGA6와 NGFR 같은 효소 스트립 표면 epitopes의 일부로서, 하나의 가능한 수정은 epitopes을 살려 효소 소화 프로토콜을 변경하는 것입니다. 이 프로토콜은 세포의 종류에 마커를 표면에 특정 항체를 변경하여 tracheal 내피 세포 또는 기타 중간 엽 세포를 분리하는 데 사용할 수 있습니다.
덕트 및 기저 세포의 분리의 한계덕트 기저 세포에서 세포와 표면 상피.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
우리는 광범위한 줄기 세포 연구 센터 FACS을 인정하고 특히 셀 정렬과의 도움을 제시카 스콜스와 시아 Codrea 감사드립니다. 작품은 CIRM RN2 - 00904-1, K08 HL074229, 미국 흉부 학회 / COPD 재단 ATS-06-065, 걱정 재단, UCLA Jonsson 종합 암 센터 흉부 종양학 프로그램 / 폐 암 포자, 캘리포니아 암의 대학 자금을 지원 한 연구 조정위원회와 Gwynne 헤이 즌 벚꽃 기념 연구소 (BG).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| 중간 열을 완료 : DMEM-F-12, 50 / 50, 1X) | Mediatech | 15-090 - CV | |
| Hepes (15 ㎜) | Invitrogen | 15,630 | |
| 나트륨 중탄산염 (3.6mM 또는 0.03 %) | Invitrogen | 25,080 | |
| L-글루타민 (4 ㎜) | Mediatech | 25-005-CL | |
| 페니실린 (100 U / ML) | Mediatech | 30-001 - CI | |
| 스트렙토 마이신 (100 μg / m) | Mediatech | 30-001 - CI | |
| Amphotericin B (0.25 μg / ML) | Lonza | 17 836R | |
| 에sulin (10 μg / ML) | 시그마 | I6634 | |
| 트랜스페린 (5 μg / ML) | 시그마 | T1147 | |
| 콜레라 독소 (0.1 μg / ML) | 시그마 | C8052 | |
| 표피 성장 인자 (25 NG / ML) | BD | 354001 | |
| 소 뇌하수체 추출 (30 μg / ML) | Invitrogen | 13028-014 | |
| 태아 소 혈청 (5 %) | 어부 | SH3008803HI | |
| Retinoic 산 (0.05 μM) | 시그마 | R2625 | |
| 성장 인자는 Matrigel을 감소 | BD | 354230 |
표 1. 미디어 구성 요소를 완료합니다.
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
|---|---|---|---|
| Pronase | 로슈 | 10165921001 | 0.15 %에서 사용 : 4 번 - O / N ° C의 소화 총 tracheal 세포를 (ALI 문화 용) 분리 할 수 -4 시간에 소화 4 ° C SMG 격리하기 |
| Dispase | BD Biosciences | 354235 | 16 단위에서 사용 : RT시 30 분 |
| DNase I | 시그마 | DN25 | 0.5 MG / ML에서 사용 : RT에서 20-30 분 |
표 2. 효소는 기관의 효소 소화에 사용됩니다.
참고문헌
- Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. Innate immune functions of the airway epithelium. Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).
- Finkbeiner, W. E. Physiology and pathology of tracheobronchial glands. Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).
- Hegab, A. E.
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