두뇌의 세포 이질에서 기본 microglia를 분리하는 것은 생리적 및 병리 학적 조건에 모두 자신의 역할을 조사하는 것이 필수적이다. 이 프로토콜은 기계적인 고립과 높은 수율과 높은 순도를 제공 혼합 세포 배양 기술에 대한 실용적 기본 microglial 세포에 대해 설명 체외에서 학업 및 다운 스트림 응용 프로그램입니다.
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이 논문에서
요약
초록
포유류의 두뇌에서 전체 세포 인구의 약 12 %를 Microglia 계정. 뉴런과 astrocytes는 신경 계통의 주요 세포 유형을 고려하는 동안 microglia는 파편과 병원균을 위해 조직을 모니터링하고 phagocytic 활동 1,2를 통해 실질 조직의 항상성을 유지하여 정상적인 뇌 생리에 중요한 역할을한다. Microglia는 neurodegenerative 질병, 외상성 뇌 손상, 그리고 신경계 감염 3를 포함해 부상과 질병 조건의 수를 동안 활성화됩니다. 이러한 작동 조건에서 microglia은 그들의 phagocytic 활동을 증가 morpohological과 proliferative 변화를 받아야하고, 적극적으로 반응 산소와 질소 종, 프로 - 염증 chemokines 및 크린 시토킨을 분비, 종종 paracrine 또는 autocrine 루프 4-6를 가동합니다. 이 microglial 답변 신경학 조건 질병 pathogenesis에 기여으로 연구 m에 초점을icroglia이 보증됩니다.
두뇌의 세포 이질 때문에, 그것은 생체내 실험의 도중에 고순도로 충분한 microglial 샘플 자료를 얻기 위해 기술적으로 어렵습니다. microglia의 neuroprotective과 neurotoxic 기능에 관한 현재의 연구는 지속적으로 연구를위한 충분한 수율와 순수하고 건강한 microglia를 생성하는 루틴 기술적 방법을 필요로합니다. 우리는, 텍스트 및 비디오에 다운 스트림 애플 리케이션의 다양한 혼합 glia 문화에서 순수 일차 microglia를 분리하기위한 프로토콜을 제시한다. 간단히,이 기술은 혼합 glial 세포 문화를 만들어 신생아 쥐 새끼에서 dissociated 뇌 조직을 활용합니다. 혼합 glial 문화 confluency 도달 후, 일차 microglia는 기계 흔들림의 짧은 기간으로 문화에서 고립된다. microglia 그러면 실험적인 연구를위한 고순도로 도금된다.
이 방법론의 원리와 프로토콜되었습니다문헌 7,8에 설명되어. 또한, 기본 microglia를 분리하기 위해 대체 방법을 잘 9-12 설명되어 있습니다. 균질 뇌 조직은 기본 microglia 12 양보하는 밀도 기울기 원심 분리로 구분됩니다. 그러나, 원심 분리는 적당한 길이 (45 분)입니다 그리고 세포 손상 및 활성화뿐만 아니라, 풍부한 microglia 및 기타 세포 인구를 일으킬 원인이 될 수 있습니다. 다른 프로토콜은 문화 9-11에있는 동안 흔들림 (16 시간) 장기간에 의해 생물의 다양한 기본 microglia를 분리하기 위해 활용되었습니다. 떨고 후 미디어 뜨는는 microglia를 분리 centrifuged있다. 이것은 더 이상 두 단계의 격리 방법도 microglial 기능과 활성화를 교란시키다 있습니다. 우리는 주로 여러 가지 이유로 저희 연구실에서 다음과 microglia 격리 프로토콜을 활용 (1) 기본 microglia (2 더 충실 불후의 쥐 microglia 세포 라인보다 생체내 생물학에서 시뮬레이션) 공칭 기계적 장애는 잠재적인 세포 기능 장애 또는 활성화를 최소화하고, (3) 충분한 수율은 혼합 glial 세포 문화가 통과하지 않고도 얻을 수있다.
그것은이 프로토콜이 microglia를 분리하기 위해 신생아의 쥐 새끼의 뇌 조직을 사용하고 microglia 상당히 고립된 microglia의 이윤율, 정품 인증 상태와 기능적 특성에 영향을 미칠 수있는 분리 이전 쥐를 사용한다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 노화가 microglia 부전, 증가 neuroinflammation 및 neurodegenerative pathologies와 연결되어있다는 증거가있다, 그래서 이전의 연구는 노화가 중요한 매개 변수는 어디에 좋은 neurodegenerative 질병에서 microglia의 역할을 이해하기 위해 전직 생체내 성인 microglia를 사용했습니다. 그러나 전직 생체내 microglia는 시간의 장시간 기간 동안 문화에 보관하실 수 없습니다. 이 프로토콜은 문화의 기본 microglia의 수명을 연장하면서 따라서, 그것은 microglia가 D를 행동 것을인지해야생체내 설정에서로 번역하면 ifferently 성인 microglia에서와 체외 연구에서 신중하게 고려되어야합니다.
프로토콜
1. 신생아 쥐 뇌 조직의 해부
- 칠이 Leibovitz의 L-15 에어컨 미디어 (레이 보위 츠 L-15 + 0.1 % BSA + 1 %의 펜 / Strep) ~ 4 ° C. 따뜻한 문화 미디어 (DMEM + 10% FBS + 1% 페니실린 / 스트렙토 마이신) 37 가기 ° C. 얼음 냉방 L-15 미디어의 4-5 ML 4 개의 60x15 mm 배양 접시를 준비합니다. 100 % 에탄올 모든 수술 도구를 소독.
- 70 % 에탄올과 P2 신생아 랩 새끼를 씻어. (P1-P5 사이에 세 신생아 쥐 새끼는이 프로토콜에서 사용할 수 있습니다.)
- 신속 멸균 날카로운 가위로 강아지 쥐의 목을 벨 및 70 % 에탄올로 바로 머리를 놓습니다. 5 쥐 새끼의 총 반복 후 생리 식염수로 머리를 전송합니다.
- 얼음 5 ML L-15 용액 (레이 보위 츠 L-15 + 0.1 % BSA + 1퍼센트 펜 / Strep) - 4 페트리 접시에 머리와 장소에서 전체 두뇌를 제거합니다.
- 1.4 쓰레기의 나머지 새끼 용 - 절차 1.2 반복합니다.
- 두뇌에서 meninges를 제거하고 DES를 전송L-15 솔루션의 4-5의 ML과 새로운 배양 접시에 ired 뇌 조직 (즉, 피질, 소뇌, 전체 뇌 ....
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토론
이 프로토콜은 정기적으로 연구 실험을위한 순수하고 건강한 microglia를 생성하기 위해 이용되는 동안 절차의 중요한 부분 중에 기술적인 관점의 신중한 검토가 고립된 microglia의 변화를 최소화합니다. 첫째, 제시간에 작업 신생아 쥐 새끼의 뇌 조직의 해부 동안 조직에 hypoxic 및 허혈성 손상을 최소화해야합니다. 그러나 meninges의 존재는 이러한 문화 조건 하에서 그들의 빠른 확산 속도로 인해 상당한 fibroblast 오염에 기여하는 것이기 때문에 완전히 절개하는 동안 두뇌에서 meningeal 덮개를 제거하는 것도 중요합니다.
혼합 glial 세포 배양의 준비 기간 동안 조직 물질 둘째, 부드러운 핸들링은 세포 손상, 사망, 또는 과도한 microglial 활성화를 제한하는 것도 중요하다. 문화 미디어를 추가할 때주의가 astrocyte 월을 손상하지 않도록 복용해야olayer. 또한, microglia 분리에 대한 flasks 흔들어 흔들어의 빈도를 조.......
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| 60mm X 15mm 배양 접시 | 피셔 브랜드 | 0875713A | |
| 샤프 해부 가위 | 파인 과학 도구 | 14094-11 | |
| 뒤몽 # 곡선 7B 포셉 표준 팁, 11cm | 파인 과학 도구 | 11270-20 | |
| 뒤몽 # 5 포셉 표준 팁, 스트레이트, 11cm | 파인 과학 도구 | 11251-10 | |
| 50 ML 원추형 원심 분리기 튜브 | VWR | 89039-656 | |
| 5 ML serological pipettes | Grenier 바이오 하나 | 606,180 | |
| 10 ML serological pipettes | Grenier 바이오 하나 | 607,180 | |
| 100 μm의 멸균 나일론 셀 스트레이너 | 매 | 35-2360 | |
| 75cm 두 조직 문화 flasks | 코닝 | 430,641 | |
| Dulbecco의 최소한의 필수적인 매체 (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz의 L-15 배지 | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| 태아 소 혈청 | Gibco (Invitrogen) | 16000-036 | |
| 태아 말 혈청 | 어부 | SH3007402 | |
| 페니실린 - 스트렙토 마이신 | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100 % 에탄올 | 워너 그레이엄 회사 | 64-17-5 | |
| 인산염은 10X 생리 식염수, 산도 7.4 버퍼 | 품질 생물학, INC. | 119-069-131 | 멸균, 증류수에 1X |
| 바이오 해저드 가방 | VWR | 14220-028 | |
| 혈구계 | Hausser 과학 | 1492 | |
| cellBIND 표면과 6도 세포 배양 접시 | 코닝 | 3335 |
참고문헌
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W.
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