전체 마우스 기관의 Multiphoton 현미경은 광학 이미징 전에 장기를 삭제하면 가능하지만, 모든 프로토콜은 형광 단백질의 형광 신호를 보존 할 수 있습니다. 에탄올 기반의 탈수 및 벤질 알코올 광학 개간 방법 사용 : 벤질 벤조산의 개간을, 우리는 전체 마우스 두뇌가 YFP을 표현의 고해상도 multiphoton 이미지를 보여줍니다.
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방법 논문
YFP를 표현 잡습니다 마우스 뇌의 Multiphoton 현미경
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
전체 마우스 기관의 고유 형광와 두 번째 고조파 세대 (SHG)의 Multiphoton 현미경은 광학 이미징 전에 장기를 삭제하여 가능하게됩니다. 1,2 그러나, GFP 및 YFP 등의 형광 단백질을 포함 기관, 메탄올을 사용하는 광학 소요되는 프로토콜 벤질 알코올 사용 탈수와 투명 : 빛 3에서 보호하면서 벤질 벤조산 (BABB)는 형광 신호를 보존하지 않습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 뉴런으로 표현 YFP의 형광 신호를 유지하면서 마우스 뇌에 전체 기관이 광학 개간을 수행 할 수있는 새로운 방법입니다. 기관은 형광 단백질에 손상을 줄이고 multiphoton 이미징 대한 형광 신호를 보존하는 것으로 확인되었습니다 에탄올 등급 시리즈를 사용하여 건조하다고 등의 광학 소요되는 프로토콜을 변경. 4 에탄올 기반의 탈수와 광학 소요의 최적화 방법을 사용하고 BABB에 의해 삭제빛으로부터 차폐하는 동안, 우리는 조직의 표면 아래 2mm 이상 마우스 뇌의 뉴런에 노란색 형광 단백질 (YFP) 표현의 고해상도 multiphoton 이미지를 보여줍니다.
프로토콜
1. 동물 재관류 5 전체 마우스 뇌 정산
- 프로 시저의 전체 길이는 탈수 단계 당 사용 시간의 길이에 따라 달라질 수 있지만, 총 전체 과정은 두 개의 일 실시 할 수 있습니다.
- YFP 마우스 무게 그리고 깊이 케타민 / xylazine (100 밀리그램 / kg : 10 밀리그램 / kg)의 intraperitoneal 주사로 마취.
- 수술하기 전에 깊은 마취의 수술 비행기를 확인합니다. 동물에게이 회사의 발가락이나 꼬리 핀치에 반응하는지 확인하기 위해 매 5 분을 확인합니다. 동물이 반응하면 케타민 / xylazine의 보충 복용 (원본 용량의 1 / 3)가 필요합니다.
- 일단 깊이 anesthetized, 마우스가 수술의 가슴 노출, 위로 향한 위치 (등쪽 recumbancy)에 있도록 실험실 테이프를 사용하여 수술 침대에 각 다리를 준수하여 마우스를 억제. 수술 침대는 보통 금속이나 플라스틱 메쉬 만든 및 세면대로 또는 입술 - 팬의 상단에 배치됩니다 있도록 혈액 및 정착액폐기물은 쉽게 수집 할 수 있습니다.
- 시작하려면 xyphoid 과정 아래 절개를합니다. 가위와 핀셋을 사용하여 갈비의 기본을 따라 잘라 컷이 완료로 피부를 뒤로 빼는거야. 마우스 가슴의 양쪽 두명 인하 (갈비....
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토론
표준 유기 염료는 유기 용제의 범위와 호환되는, 따라서 프로토콜을 삭제하기위한 특정 과제를 포즈를하지 않는 반면, 형광 단백질은 용매에 자주 변화를 덜 관대합니다. 현재 작업의 4 목표는의 심각한 한계를 극복하는 것이 었습니다 XFPs의 형광이 분실 또는 심각하게 저하 된 이전 광학 소요되는 프로토콜. 여기에 표시되는 이미지가 YFP의 형광을 보존되었다고 보여줍니다. 여기에 설명 된 광학 소요되는 기술은 조직의 표면 아래 2mm로 전체 마우스 뇌 YFP - 분류 뉴런까지의 고해상도 이미징 할 수 있습니다. 이전에 보여준 것처럼, 에탄올 탈수를 사용하여도 녹색과 빨간색 형광 단백질 신호를 유지합니다. 여기에 광학 소요되는 기술은 이러한 해마 나 네크로 그 표현 형광 단백질로 전체 기관이 지역을 공부하고 적용 할 수있는 방법을 보여줍니다를 보여 4 이미지. 고multiphoton 현미경의 해상도 기능도 장기 지역 내 관심의 특정 셀 또는 지역의 맑은 확대 할 수 있습니다. 단백질 형광을 유지.......
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공개 사항
동물 실험은 예일 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
감사의 글
우리는 비디오 편집에서 자신의 도움을 야곱이 솔리스 감사드립니다.
이 작품은 MJ Levene에 NSF 경력 수상 DBI-0953902이 부분에 자금을 지원했다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| 인산염은 식염 버퍼 | 시그마 - 알드리치 주식회사 | D8537 | 500 ML, pH를 7.2 |
| Paraformaldehyde | 전자 현미경 과학 | 15,710 | 10 × 10 ML, 16 %의 paraformaldehyde |
| 에틸 알코올 | Bioanalytical 미국 | AB00515-00500 | 500 ML, 200 증명 |
| 에틸 알코올 | Pharmco 제품, 주식회사 | 111000190 | 한 여자., 190 증명 |
| 벤질 알코올 | 시그마 - 알드리치 주식회사 | 402834 | 500 ML 99 + % |
| 벤질 벤조산 | 시그마 - 알드리치 주식회사 | B6630-IL | 500 ML, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA 목표 | 니콘 | 5 배 AZ 계획 밀가루 | 15 WD |
참고문헌
- Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. Multiphoton microscopy of cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 15, 036017(2010).
- Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence....
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재인쇄 및 허가
