상피 세포가 3 차원 세포 골재 형성의 결과로 생리적 조건에서 성장할 수있는 회전 세포 배양 시스템이 설명되어 있습니다. 집계는 디스플레이를 생성 생체내에서 같은 특성은 종래의 문화 모델에서 관찰과 과학적 조사의 다수에 대한보다 정확한 organotypic 모델 시스템으로 사용할 수 없습니다.
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이 논문에서
요약
초록
셀 및 신체 경험들이 건축에 영향을 미치는 환경 조건, 세포 통신, 그리고 전반적인 기능의 조직. 체외 세포 배양 모델에 정확하게 흥미 조직을 모방하기 위해서는 문화의 성장 환경은 고려해야 할 중요한 측면이다. 일반적으로 사용되는 기존의 세포 배양 시스템은 평면 (2 차원) 2 차원 스며들지 않는 표면에 상피 세포를 증식. 많이는 기존의 세포 배양 시스템에서 배운되었지만, 많은 연구 결과는 잠재적으로 생리학 관련 microenvironment의 부족의 결과로, 인간 임상 실험이나 조직 explants에서 재현할 수 없습니다.
여기서는 혁신적인 회전 벽 혈관 (RWV) 생물 반응기 기술을 사용하여, 2 차원 세포 배양의 문화 조건 경계의 많은를 극복하는 문화 시스템을 설명합니다. 우리와 다른 organotypic RWV 파생 모델 structur을 요점을 되풀이 수있는 것으로 나타났습니다전자, 기능과 마찬가지로 인간 explant 조직 1-6 외부 자극에 본격적인 인간의 반응. RWV의 생물 반응기는 낮은 생리 유체 전단 조건 하에서 상피 세포의 성장을 허용 서스펜션 문화 시스템입니다. bioreactors는 두 가지 형식으로, 높은 측면 회전 용기 (하브) 또는 그들의 폭기 소스에 따라 다릅니다하는 천천히 돌려 측면 혈관 (STLV)로 왔습니다. 상피 세포는 다공성, 콜라겐 코팅 microcarrier 비즈 (그림 1A)와 함께 선택의 생물 반응기에 추가됩니다. 세포 생물 반응기에서 일정한 자유 낙하 (그림 1B) 동안 성장을 발판으로 구슬을 활용. 생물 반응기에서 제공하는 microenvironment는 세포가 종종 표준 2 차원 배양 조건 (그림 1D)에서 관찰되지 생체내 같은 특성으로 표시 (3-D) 입체 집계를 형성 할 수 있습니다. 이러한 특성은 꽉 분기점, muc 포함생체내 단백질 지방화 및 추가 상피 세포 타입의 특정 속성의 회사 생산, 기저 / 혀끝의 방향.
완전히 차별화된 3 차원 집계에 상피 세포 단일층의 진행은 셀 타입 1, 7-13에 따라 다릅니다. 생물 반응기에서주기적인 샘플링은 상피 집계 형성, 세포 분화 마커와 생존 (그림 1D)의 모니터링을 허용합니다. 일단 세포 분화 및 골재 형성이 설정되고, 세포가 생물 반응기에서 수확하고, 유사한 assays는 2-D 세포에서 수행된 몇 가지 고려 사항 (그림 1E-G)와 3 차원 집계에 적용할 수 있습니다. 이 작품에서 우리는 어떻게 문화의 RWV의 생물 반응기 시스템의 3 차원 상피 세포 집계하고 3 차원 합산으로 실행될 수있는 잠재적인 assays와 분석 다양한 있습니다. 세부 단계를 설명 이러한 분석을 포함하지만, M / 구조에 국한되지 않습니다orphological 분석 (공촛점, 검사 및 전송 전자 현미경), 시토킨 / 케모카인 분비 및 세포 신호 전달 (cytometric 비드 배열과 서양 얼룩 분석), 유전자 발현 분석 (실시간 PCR), 마약 / toxicological 분석과 호스트 병원체 상호 작용. 이러한 assays의 활용도는 metabolomics, transcriptomics, proteomics 및 기타 어레이 기반 응용 프로그램을 더욱 깊이와 광대한 연구를위한 토대를 설정합니다. 우리의 목표는 다양한 과학적인 이해 관계와 연구자에 의해 사용될 수있는 손쉬운하고 안정적인 시스템에서, 생체내 조직의 인간을 요점을 되풀이하다 organotypic 3 차원 모델을 생산하는 culturing 인간 상피 세포가 아닌 종래의 방법을 제시하는 것입니다.
프로토콜
모든 단계 층류 후드의 BSL-2 조건 하에서 수행되어야합니다.
1. STLV 생물 반응기 준비
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 STLV 생물 반응기를 구성하고 생물 반응기의 불임을 보장하기 위해 해독 프로토콜을 수행합니다. luer 대문자로 열려있는 포트를 커버와 24 H를위한 95 %의 에탄올과 STLV 채우십시오.
- 에탄올을 제거와 24 H를위한 멸균 증류수로 STLV 채우십시오.
- 전용 멸균 증류수로 1.2 단계를 반복합니다.
- 공급 업체에서 제공하는 도구를 살균 주머니에서 20 분 동안 110 ° C에서 모든 나사, 모자, 센터 플러그인 STLV에서, 그리고 압력솥을 푸세요.
- STLV이 냉각되면, 나사를 조여 및 불임과 완전한 해독을 보장하기위한 조치 1.1-1.4를 반복합니다.
- 각 포트에 대한 사전 소독 단방향 stopcocks에 STLV와 나사를 냉각의 나사를 조이십시오.
- 수직 손잡이를 배치한를 엽니다 꼭지.
- 다시 래퍼의 불임을 유지하기 위해 10 ML 5 ML luer 잠금 주사기 및 재 슬리브 plungers에서 plungers를 제거합니다. stopcocks쪽으로 주사기 (luer 잠금 ....
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토론
여기에 제시된 RWV의 생물 반응기 기술의 활용은 더욱 생리학 관련 organotypic 세포 배양 모델은 현재 세포 배양 시스템을 발전하기 위해 능력과 연구자를 제공할 수 있습니다. RWV의 생물 반응기의 세포 배양 시스템이 꽉 분기점, mucin 생산, 세포외 프로세스 (예 : microvilli)와 세포 극성을 포함하여 생체내 같은 특성에서와 3 차원 세포 집합체를 형성하는 세포를있게 낮은 전단 microenvironment를 제공합니다. 여기에 제시된 데이터 및 예제 대부분 RWV 시스템에서 자란 질 상피 세포를 사용하고 있지만 RWV 시스템은 또한 소형 및 대형 소장, 폐, 방광, 간, 그리고 편도선 상피 세포를 포함한 문화의 다른 상피 세포 유형으로 사용되었습니다 3 차원 organotypic 모델 1, 7-13, 18를 형성합니다. 또한이 시스템은 상피 세포가 아닌 다른 문화 셀 유형으로 사용되고 있으며 복잡한 multicel의 현재 개발lular organoty.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
저자는 자신의 단백질 분석을 위해 그녀의 기술력과 앤드류 라센 위해 브룩 Hjelm 감사드립니다. 이 작품은 대안 연구 개발 재단 (MMHK) 그랜트와 NIH NIAID 성병 감염 및 연고제 Microbicides 협동 연구 센터 IU19 AI062150-01 (MMHK)에 의해 부분적으로 재정 지원되었다. 우리는 기꺼이 그 인물의 재사용을위한 복제의 생물을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| 알렉사 형석 488 | Invitrogen | A21131 | 1:500 희석에 사용 |
| FACSDiva | BD | 흐름 cytometer | |
| β-tublin 항체 | Calbiochem | 654,162 | 1:5000 희석에 사용 |
| 바이오 플렉스 2000 | BioRad | 171-000205 | V5 소프트웨어 |
| 생물 반응기 및 구성 요소 | Synthecon | RCCS-4 | |
| 셀 스트레이너 | BD 팔콘 | 352,340 | 40μm 기공 크기 |
| 원뿔 튜브 (50mL) | 코닝 | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR | 48366067 | |
| 시토킨 비드 어레이 키트 | BioRad | 맞춤 인간 키트 | |
| Cytodex 비즈 | 시그마 | C3275 | |
| DPBS | Gibco | 14,190 | |
| EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 시그마 | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic 산 |
| 상피 특정 항체 (ESA) | Chemicon | CBL251 | 1시 50분 희석에 사용 |
| 태아 소 혈청 (FBS) | Gibco | 10,438 | inactivated 히트 |
| 하브 (일회용) | Synthecon | D-405 | |
| 염산 | 시그마 | 258,148 | 37% |
| Involucrin 항체 | 시그마 | 전 9018 | |
| 현미경 슬라이드 | VWR | 16004-368 | |
| MTT 시약 | MP Biomedicals, LLC | 194,592 | 3 - (4,5-Dimethylthiazolyl 1-2) -2,5 - 디페닐 Tetrazolium 브로마이드 |
| MUC1 항체 (현미경) | 산타 크루즈 | SC-7313 | 1시 50분 희석에 사용 |
| MUC1 항체 (유동세포계측법) | BD Pharmingen | 559,774 | 또한 CD227라는, 테스트 당 20μL를 사용하여 |
| Paraformaldehyde | 전자 현미경 과학 | 15,710 | DPBS에서 4 %로 희석 |
| 페트리 접시 (작은) | BD 팔콘 | 353,002 | |
| 필터 폴리스티렌 관 | BD 팔콘 | 352,235 | |
| 폴리스티렌 유동관 | BD 팔콘 | 352,058 | |
| 홍보 항체 | DAKO | M3569 | 1:100 희석에 사용 |
| 골드을 연장 | Invitrogen | P36931 | DAPI로 마운트 미디어 |
| RNeasy 미니 키트 | Qiagen | 74,903 | |
| 나트륨 dodecyl 황산 | 시그마 | 71,725 | |
| 살균 파우치 | VWR | 11213-035 | |
| Stopcocks (편도) | Medex | MX5061L | |
| 주사기 (10mL) | BD | 309,604 | Luer-잠금 팁 |
| 주사기 (5mL) | BD | 309,603 | Luer-잠금 팁 |
| Trypan 블루 | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 항체 | 산타 크루즈 | SC-13525 | HSV-2 항체 클론 6F10, 1:5000 희석에 사용 |
참고문헌
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
- Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M.
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