Method Article

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

DOI:

10.3791/3884

⸱

June 8th, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Microbiology and Preventive Medicine, Iowa State University, 2Amnis Corporation, 3Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

In This Article

Summary

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이 문서에서는 RAW 264.7 세포에 의한 polyanhydride의 nanoparticles이나 박테리아의 내면화를 수치 멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법을 활용한 방법을 설명합니다.

Abstract

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Nanoparticulate 시스템은 항원 제시 세포를 1-5으로, 효율적으로 단백질을 포함하여화물을 전달하는 능력을 통해 백신 전달에 유용한 도구로 등장했습니다. 항원 제시 세포에 의해 nanoparticles의 내면화 (NP)는 캡슐화된 항원에 대한 효과적인 면역 반응을 생성에 중요한 단계입니다. nanoparticle 제제 영향을 미치는 기능에 어떻게 변경 사항을 확인하려면, 우리는 internalized nanoparticles뿐만 아니라 박테리아를 검출과 호환였다 높은 처리량, 양적 실험 프로토콜을 개발하기 위해 모색하고 있습니다. 현재까지, 두 개의 독립적인 기법, 현미경 및 유동세포계측법는 nanoparticles의 phagocytosis를 연구하는 데 사용되는 방법 왔습니다. 유동세포계측법의 높은 처리량 본질은 강력한 통계 데이터를 생성합니다. 그러나, 낮은 해상도로 인해, 그것은 정확하게 셀 바운드 nanoparticles 비해 internalized 수치 실패합니다. 현미경은 높은 공간적 해상도로 이미지를 생성합니다; However, 그건 시간이 소요되며 작은 샘플 크기에게 6-8을 포함한다. 멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 (MIFC)는 판상 코어를 통해 동시에 멀티 컬러 스펙트럼 형광 및 명시야 현미경 이미징을 수행하고 유동세포계측법 양쪽 측면을 통합함으로써 새로운 기술입니다. 이 기능은 형광 신호 강도와 다양한 구조와 고속 세포 기능 사이의 공간적 관계의 정확한 분석을 제공합니다.

여기, 우리는 polyanhydride의 nanoparticles이나 살모넬라 enterica serovar Typhimurium을 internalized 않은 세포 인구를 특성화하기 위해 MIFC을 활용한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 nanoparticle의 현탁액, 세포 라벨, ImageStream X 시스템의 취득 및 아이디어 응용 프로그램을 사용하여 데이터 분석 준비에 대해 설명합니다. 또한 국제화 P를 차별화하는 데 사용할 수있는 기술의 응용을 설명actin - 중재의 phagocytosis의 억제제로서 cytochalasin-D를 사용하여 nanoparticles와 박테리아 athways.

Protocol

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1. RAW 264.7 세포 배양

  1. 그들은 세포 스크레이퍼로 부드럽게 그들을 위해서 힘든하여 confluency 도달 자신 flasks에서 수확 RAW 264.7 세포. 10% 열 inactivated 태아 소 혈청 (FBS), 2 MM Glutamax,, 5 × 10 5 세포의 밀도 /도 0.5 ML 전체 Dulbecco의 수정일 독수리 매체 (cDMEM의에서 24도 세포 배양 접시에 카운트 및 플레이트 그들 10 MM HEPES)와 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 밤새 품어.

2. 병원성 살모넬라 enterica Serovar Typhimurium 14,028 변환과 문화

  1. S로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 재조합 plasmids을 소개합니다. electroporation에 의해 Typhimurium. 첫째, LB의 국물에 살모넬라 enterica serovar Typhimurium (ATCC 14028)의 문화를 준비하고 폭기와 37 ° C에서 밤새 품어.
  2. 다음날, microcentrifuge의 최대 속도로 박테리아의 펠릿 1 ML. 세포에게 구경 씻으부드럽게 각....

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Discussion

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연구는 폴리 (락트 - 공동 glycolic 산 (PLGA) 또는 polyanhydrides을 기반으로 생분해성 nanoparticles는 대상 세포를 캡슐 항원이나 약물을 전달하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났습니다. phagocytic 세포에 의해 이러한 nanoparticles의 이해 이렇게 양적으로 만들어 그들의 효과를 위해 중요하다 . 소설 nanoparticle 전달 시스템을 설계에서 중요한 내면화의 분석이 방법을 사용함으로써는 다양한 세포 유형별로 nanoparticles의 차등 이해가 쉽게 분석할 수 있으며, 종래의 현미경 및 유동세포계측법 데이트를하려면 입자 이해를 quantifying에 사용되었습니다;.하지만, 각각의 높은 처리량 및 내면화를 공부하는 다른 접근 방법을위한 해상도의 호출로 제한.이 문서에서 우리는 특성화와 phagocytosis의 생물 학적 과정 목표 - 세균성 병원체 및 합성 nanoparticles의 두 유형 간의 차이가 어떻게 비교할 MIFC 분석을 수행합니다.

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Disclosures

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Sherree L. 친구는 ImageStream의 X 시스템을 제조 Amnis 회사에 의해 고용된다.

Acknowledgements

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저자는 금융에 대한 ONR-MURI 수상 (NN00014-06-1-1176)과 미군 의료 연구 및 Materiel 명령을 (부여 번호 W81XWH-09-1-0386 및 W81XWH-10-1-0806) 감사드립니다 지원합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 댓글
RAW 264.7 세포주 미국 유형 문화 수집 (ATCC) 티비 - 71
Dulbecco의 수정일 독수리 중간 (DMEM) Cellgro 10-013 - 이력서
태아 소 혈청 애틀랜타 체액 S 11,150 프리미엄 학년
Glutamax Gibco 35050-061
HEPES Gibco 15630-080
24 잘 플레이트 TPP 92,024
세포 배양 Flasks TPP 90,151
셀 스크레이퍼 TPP 99,002 24cm
살모넬라 enterica serovar Typhimurium ATCC 14,028
BTX ECM630 전기 세포 조작하는 사람 BTX 하버드 장치
맙스 피셔 과학 BP308
인산염은 식염수 (PBS)를 버퍼 Cellgro 21-040 - 이력서
초음파 액체 프로세서 MISONIX S-4000
Cytochalasin-D 시그마 - 올드 리치, C8273
포름 알데히드 Polysciences 04,018
버퍼를 씻으십시오 2퍼센트 열 inactivated FBS, PBS에 0.​​1 %의 나트륨 azide.
버퍼를 씻고 / 파마 BD Biosciences 554,714
스냅 캡 microtubes를 클리어 뷰 시그마 T4816
알렉사 형석 phalloidin 660 Invitrogen A22285
ImageStream X Amnis Corpora기 100,200 옵션 : 658nm 레이저, autosampler
나트륨 azide 피셔 과학 S 227I-500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642(2011).
  2. Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jac....

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