여기에 설명된 mesothelial 통관 분석은 fluorescently 표시된 셀 및 촬영된 비디오 현미경 시각화하고 양적 난소암 다세포 spheroids 및 mesothelial 세포 monolayers의 상호 작용을 측정하기 위해 활용합니다. 이 분석은 난소 암 전이의 초기 단계를 모델.
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이 논문에서
요약
초록
난소암은 미국 1의 암 관련 사망의 다섯 번째 주요 원인이다. 치료에 긍정적인 초기 대응에도 불구하고 난소암과 여성의 70~90% 새로운 metastases을 개발하며, 재발은 종종 두 치명적이다. 그것은 중급과 늦은 무대 난소암 더 나은 치료법을 개발하기 위해 보조 metastases가 발생하는지 이해하기 위해, 따라서 필요합니다. 악성 세포가 일차 종양이 사이트에서 분리 및 복막 캐비티 전체에 보급하면 난소암의 전이가 발생합니다. 전파 세포가 복막 구멍 3 (그림 1, 영화 1) 내의 장기에 다세포 클러스터, 또는 spheroids 역시 남아 맨몸으로, 아니면 임플란트를 형성할 수 있습니다.
복막 캐비티 내의 장기의 모든 mesothelial 세포를 4-6 (그림 2) 단일, 연속, 레이어로 채워져 있습니다. 그러나 mesothelial 세포 수렁에서 결석입니다같은 excised 인간 종양 조직 섹션 3,5-7 (그림 2)의 전자 현미경 연구에 의해 밝혀 복막 종양 유출. 이것은 mesothelial 세포를 알 수없는 프로세스에 의해 종양이 대량 수렁에서 제외됩니다 것을 제안합니다.
체외 실험에서 이전은 기본 난소암 세포 8 mesothelial 세포보다는 세포외 기질에 더 효율적으로 첨부하고, 더 최근의 연구는 그 기본 복막 mesothelial 세포가 실제로 난소암 세포 부착 및 침입 (같은 접착 및 침략에 비해에 장벽을 제공 보여주 것을 증명 ) mesothelial 세포에 9,10을 취재되지 않은 기판에. 이것은 mesothelial 세포가 난소 암 전이에 대한 장벽 역할을하는 것이 좋습니다 것이다. 난소암 세포가이 장벽을 위반하고있다 mesothelium를 제외하는 세포와 분자 메커니즘은 최근까지 알려지지 않았다.
여기 일을 설명시험 관내 분석을위한 전자 방법론 해당 모델 생체내 (그림 3, 영화 2) 난소암 세포 spheroids과 mesothelial 세포 사이의 상호 작용. 우리의 프로토콜은 mesothelial monolayers 8-16과 난소 종양 세포의 상호 작용 분석을위한 앞에서 설명한 방법에서 적응되었고, 먼저 난소 종양 세포의 배제를 추진 마이 오신과 견인 힘을 인테 종속 활성화를 활용 보여주는 리포트에서 설명되었다 종양 회전 타원체 17 세 이하의 mesothelial 세포. 이 모델은 상호 작용의 공간적 및 시간적 정보를 제공하고, 실시간으로 두 세포 인구를 모니터링하는 데 시간이 경과 형광 현미경을 이용합니다. mesothelial 세포가 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 동안 난소 암 세포는 빨간 형광 단백질 (RFP)를 표현. RFP-표현하는 난소암 세포 spheroids하면 GFP-표현 mesothelial 단일층에 첨부해 주시기 바랍니다. spheroids 확산은 침공, 그리고옆으로 단일층에 구멍을 만드는 mesothelial 세포를 강제로. 이 구멍은 GFP 이미지의 부정적인 공간 (블랙)와 같은 시각이다. 구멍의 지역 그리고 양적 통제와 난소암 및 / 또는 mesothelial 세포 실험 집단 간의 클리어런스 활동의 차이를 분석하는 측정 수 있습니다. 이 분석은 난소암 세포 (조건 회 회전 타원체 X 20-30 spheroids 당 100 세포)만이 소수의 필요 때문에 귀중한 일차 종양 세포 샘플을 사용하여이 분석을 수행 가능합니다 이상입니다. 또한이 분석은 쉽게 높은 처리량 검사에 대해 적용할 수 있습니다.
프로토콜
1. 난소암 세포 회전 타원체 형성
- RFP-표현하는 난소암 세포는 10 %베이스 중간 (199과 MCDB105의 50:50 혼합물 10 % inactivated 태아 소 혈청과 1% 펜 strep를 포함하는 사용자 정의 세포 배양 매체)에서 배양해 있습니다. 레이블이 지정되지 않은 난소암 세포에 RFP를 표현하기 위해 플라스미드 포함된 RFP와 세포를 transfect 및 RFP를 표현하는 세포를 위해 선택합니다. 또는 바이러스성 벡터는 transiently 형광 단백질을 표현하는 데 사용할 수있는, 또는 세포에 빨간색 형광 세포 추적기 염료 (Invitrogen)로 사전 품어 될 수 있습니다.
- 이전 난소암의 spheroids의 형성에, 그것은 낮은 접착 96 잘 둥근 바닥 문화 요리를 준비할 필요가 있습니다. , 낮은 접착 배양 접시를 생산하기 위해서 30μl 폴리-HEMA 용액 (1 ML 95% EtOH에서 6mg polyhydroxyethylmethacrylate)는 96 잘 코닝 세포 배양 접시의 각도에 추가됩니다. 96 잘 플레이트는 ° C 비 humidified 인큐베이터는 에탄올, 내가 증발시키는 37에 incubated 있습니다각도에 폴리-HEMA의 영화를 eaving. 이 폴리 - HEMA 영화는 세포 현탁액 18 년....
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토론
여기에 제시된 "Mesothelial 정리 분석은"훌륭한 공간과 시간적 자세히, 난소암 다세포 spheroids 및 mesothelial 세포 monolayers의 상호 작용을 모니터링하기 위해 촬영된 현미경을 사용합니다. 이전에는 8-14 몇몇 그룹은 난소암 세포가 부착하고 mesothelial 세포 monolayers에 침공 표시하도록 끝점 assays를 사용했다. 이 분석은 독특한 점에서이 두 세포 인구의 역학은 검정에 걸쳐 모니터링할 수 있도록, mesothelial 세포에서 종양 세포를 구별할 fluorescently 라벨 세포를 사용합니다. 윤달의 과정은 실시간으로 시각 수 있으며 mesothelial 통관의 요금은 양적 시간이 지남에 따라 측정할 수있다. timelapse 현미경의 사용은 하나가 밀접하게 서로 다른 실험 조건에서 두 세포 집단 사이의 상호 작용의 역학을 관찰 할 수 있습니다. 또한 mesothelial 세포 또는 난소 암 CE 하나의 작은 비율재편은 인구 내에서.......
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공개 사항
우리는 공개 할게 없다.
감사의 글
우리는 하버드 의과 대학에서 니콘 이미징 센터, 특별히 제니퍼 워터스, 라라 Petrak과 웬디의 연어, 훈련과 timelapse의 현미경의 사용을 감사드립니다. 우리는 또한 가치있는 토론을 위해 로자 잉과 Achim Besser 감사드립니다. 이 작품은 NIH 그랜트 5,695,837 (M. Iwanicki까지) 및 JSB에 GM064346에 의해 지원되었다; 박사 미리암과 셀던 G. Adelson 의학 연구 재단 (JSB까지)에서 교부금에 의해.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| OVCA433 난소 암 세포 | 박사 데니스 Slamon의 선물 | ||
| Mesothelial 셀을 ZT | 박사 탄의 선물 Ince | ||
| 중형 199 | Gibco | 19,950 | |
| MCDB105 | 세포 응용 주식 회사 | 117-500 | |
| FBS-더위 inactivated | Gibco | 10,082 | |
| 펜-Strep | Gibco | 15,070 | |
| 96 잘 접시 | 코닝 Costar | 3799 | |
| Polyhydroxyethylmethacrylate (폴리-HEMA) | 시그마 알드리치 | 192066-25G | 폴리 - HEMA 솔루션을 95 % EtOH의 1ml에 6mg 폴리 - HEMA 분말을 용해 |
| EtOH | Pharmco-aaper | 111ACS200 | DH 2 0에서 95 %까지 희석 |
| 세포 배양 후드 | Nuaire | NU-425-300 | |
| 조직 문화의 인큐베이터 | 써모 과학 | 3110 | |
| 폴리 - HEMA 플레이트위한 인큐베이터 | Labline 악기 | 제국 III 305 | |
| 탁상 원심 분리기 | Heraeus | 75003429 / 01 | |
| 6 잘 유리 바닥 요리 | MatTek 사. | P06G-1.5-20-F | |
| Fibronectin | 시그마 | F1141-1MG | |
| PBS | Cellgro | 21-040 - 이력서 | |
| Timelapse 현미경 : | |||
| 현미경 | 니콘 | 통합된 완벽한 초점 시스템과 티-E 바뀌 동력 형광 촬영된 현미경 | |
| 렌즈 | 니콘 | 20X-0.75 수치 apeture | |
| 할로겐 transilluminator | 니콘 | 0.52 없음 긴 작동 거리 응축기 | |
| 여진과 방사 필터 | 니콘 주택 채도 단일 패스 필터 | GFP 예 40분의 480, 엠 50분의 525 RFP-mCherry 예 50분의 575 엠 50분의 640 | |
| 전송 및 광 경로를 Epifluoresce | 셔터 | 스마트 셔터 | |
| 선형 인코딩 동력 무대 | 니콘 | ||
| 냉각 충전 - 결합 장치 카메라 | 하마 마츠 | 오카-AG | |
| 온도 및 CO 2 제어 현미경 보육 챔버 | 주문품의 | ||
| 진동 절연 표 | TMC | ||
| 국정원 - 요소 소프트웨어 | 니콘 | 버전 3 |
참고문헌
- Jemal, A. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
- Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. Available from: http://seer.cancer.gov/csr/1975_2005 (2007).
- Burleson, K. M.
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재인쇄 및 허가
