Nanodisc 지질 입자로 ABC의 전송의 Reconstitution을위한 단계별 방법

요약

Nanodiscs는 인지질 이중층의 작은 패치로 막 단백질을 포함 작은 원반 모양의 입자입니다. 우리는 디스크에 MalFGK2 수송의 단계별 설립을 보여줍니다 시각적 프로토콜을 제공합니다.

초록

nanodisc는 discoidal 입자 (~ 10-12 nm의 넓은)는 트랩 막 단백질 인지질 이중층의 작은 패치로.입니다 nanodisc 특히 리간드 - 수용체 상호 작용의 맥락에서, 막 단백질을 공부에 특히 매력적인 옵션입니다. 방법은 Sligar에 의해 개척 및 동료는 apolipoprotein A1에서 파생 설계 높은 - 나선형 비계 단백질의 amphipathic 특성에 기반을두고 있습니다. 극지방의 수성 환경에 직면 반면 비계 단백질의 소수성 얼굴은 지질 이중층의 지방산 아실 사이드 체인과 상호 작용할 수 있습니다. 입자가 작은 균질하고 수용성이기 때문에 nanodiscs의 막 단백질의 분석은 리포좀에 비해 상당한 장점이 있습니다. 또한, 일반적으로 수용성 단백질에 예약 생​​화학 및 biophysical 방법이 적용하고 막 양쪽에서 할 수 있습니다. 이 시각 프로토콜에서, 우리는 잘 charac의 단계별로 reconstitution을 제시terized 세균 ABC의 전송, 남성 _MalFGK이 복잡. 디스크의 형성은 세제의 진보적 인 제거에있어 소수성 상호 작용에 따라 자기 조립 과정입니다. 우리는 필수적인 단계를 설명하고 우리는 집계 및 큰 polydisperse 리포좀과 같은 입자의 형성을 제한하기 위해 올바른 단백질 - 투 - 지질의 비율을 선택의 중요성을 강조 표시합니다. 간단한 품질은 디스크가 올바르게 재구성되었는지 확인 겔 여과 크로마토 그래피, 기본 겔 전기 영동 및 동적 광 산란 분광법으로 제어합니다.

프로토콜

전체 Reconstitution 프로세스

reconstitution 과정은 세제 - solubilized phospholipids의 존재에 정화 _MalFGK이 컴플렉스로 ​​막 비계 단백질 (MSP)를 혼합하여 시작합니다. 단계는 바이오 비즈 나 Amberlite (그림 1)라는 흡착제 폴리스티렌 소재로 세제의 느린 제거을합니다. 자동 조립 공정 때문에 소수성 phospholipids, _MalFGK이 복잡하고 MSP amphipathic 단백질의 표면 사이의 apolar 상호 작용의 가능성이 가장 높은 발생합니다. 최종 제품은 _MalFGK이 복잡한 주변 MSP 포장의 두 분자로 만든 원반 모양의 입자입니다. 입자는 초 원심 분리 및 분석 크기 배제 크로마토 그래피에 의한 알데히드 부가 물 및 집계에서 구분됩니다. 입자는 기본 - 겔 전기 영동 및 동적 광 산란 분광법을 특징으로하고 있습니다.

막의 제목 "> 1. 준비 비계 단백질, MSP

1. 자신의 태그 MSP는 (버전 MSP1D1 ¹⁾ E.의 플라스미드 pMSP1D1에서 생산됩니다 대장균 37 3 시간 0.5 MM ....

토론

우리는 nanodiscs에 말토오스 수송의 reconstitution에 대한 간단한 절차를 설명합니다. 전송은 ATPase 활성 상태이며 수용성 바인딩 파트너 남성과의 상호 작용은 (그림 3) 재현 할 수 있습니다. nanodiscs에 전송의 성공 reconstitution 추가 biophysical 및 생화학 분석 방법을 엽니 다. 특히 관심 MalK ATPase 및 세제의 말토오스 수송 활동, 리포좀과 nanodiscs 체계적인 분석됩니다. ABC의 이동 장치는 전송 사이클 동안 conformations을 변경할 수 있지만, 이러한 conformational 변화에 지질의 기여는 탐험 할 수 남아 있습니다.

nanodisc의 제작은 비교적 간단하면서도 최적의 조건에서 작은 편차는 단백질 집계를 돌이킬 수없는 될 수 있습니다. 지질의 초과 금액 productio로 이어질 것이기 때문에 지질 비율 :이 보고서에서, 우리는 올바른 단백질을 선택의 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
Amicon 울트라-4 50K 원심 필터	Millipore	UFC805008	적절한 사용을 위해 제조업체의 규정을 따르
바이오 비즈 SM-2 흡착제	바이오 RAD	152-3920
대장균 총 지질	벤티 폴라 지질	100500C	클로로포름에 용해, 유기 용매에 따라 처리
니켈 세 파로스 HP 수지	GE 헬스 케어	17-5268-01
인 표준 솔루션	시그마 - 알드리치	P3869
pMSP1D1	Addgene	20,061
Superdex 200 HR 3백분의 10	GE 헬스 케어	17-5172-01
			표 I. 특정 시약.
			이름 구성 코멘트 DDM 주식 10% w / V DDM -20 ° C에서 milliQ 물과 저장소에 Resuspend MalFGK이 주식 1-2 MG / ML 50 MM 트리스 - HCL, pH7.9 100 MM NaCl 10% 브이 / v 글리세롤 0.03 % w / V DDM -70에서 저장 ° C 정화 후 MSP 주식 10-15 MG / ML 50 MM 트리스 - HCL, pH7.9 100 MM NaCl 10% 브이 / v 글리세롤 -70에서 저장 ° C <1 ML의 aliquots에서 정화 이후 과도한 동결 / 해동 사이클을 방지 인지질 재고 5 NM E. 대장균은 지질를 집계 0.5 % w / V (10 ㎜) DDM 50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.9 50 MM NaCl 일주 4 ° C에서 저장 TS 버퍼 50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.9 50 MM NaCl 4에 저장 ° C TSG10 버퍼 50 MM 트리스 - HCL, pH7.9 100 MM NaCl 10% 브이 / v 글리세롤 4에 저장 ° C TSG20 버퍼 50 MM 트리스 - HCL, pH8 100 MM NaCl 20% 브이 / v 글리세롤 4에 저장 ° C TSGD 버퍼 50 MM 트리스 - HCL, pH7.9 100 MM NaCl 10% 브이 / v 글리세롤 0.03 % w / V DDM 4 ° C에서 저장 불과 사용하기 전에 DDM을 추가 표 II. 솔루션 요리.