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방법 논문

중추 신경계에서 Transducing 전지 Lentiviral 벡터 제작

36.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/4031

⸱

2012년 5월 24일

 ,  ,  , 
1Department of Neurology and Hope Center for Neurological Disorders, Washington University School of Medicine

이 논문에서

요약

이 프로토콜에서는 생산, 정제 및 lentiviral 벡터의 적정을 설명합니다. 우리는 기본 교양 뉴런과 astrocytes의 lentiviral 벡터 매개 유전자 전달의 예제를 제공합니다. 우리의 방법은 다른 세포 유형에도 적용될 수 체외에서과 생체내에서.

초록

중추 신경계 (CNS)에서 효율적인 유전자 전달 신경학적인 질병 모델링 및 치료 접근법을 개발, 유전자 기능 연구에 중요하다. Lentiviral 벡터들은 모두 분리 및 비 나누어 세포, transgenes 지원하는 지속적인 표현을 transduce으로 CNS의 뉴런과 다른 세포 유형의 형질 도입에 매력적인 도구이며, 비교적 큰 포장 용량과 낮은 독성 1-3 있습니다. Lentiviral 벡터가 성공적으로 체외 4-6에서 많은 신경 세포 유형을 transducing과 7-10 동물에 사용되었습니다.

그레이트 노력 향상된 biosafety 및 유전자 전달을위한 효율 lentiviral 벡터를 개발되었습니다. 현재 3 세대 복제 - 결함과 자기 운영을 중지시키지 (SIN) lentiviral 벡터는 그림 1에 표시됩니다. 벡터 포장을위한 필수 요소 네 가지 plasmids 나뉘어있​​다. lentiviral 트랜스에서플라스미드 하기까지, 5 '긴 터미널 반복 (LTR)의 U3 영역은 다른 바이러스의 강력한 모터로 대체됩니다. 이 수정은 일반적으로 HIV 유전자 발현 11가 필요합니다 HIV-1 두드리는 단백질의 벡터 시퀀스의 전사 독립 있습니다. 포장 신호 (Ψ)가 encapsidation와 레브 - 반응 요소 (RRE)에 필수적인 높은 titer 벡터를 제작할 필요합니다. 중앙 polypurine 요로 (cPPT)는 벡터 DNA의 핵 수입이 아닌 분열하는 세포에게 12 transducing에 필요한 기능을 위해 중요하다. 3 'LTR에서 CIS-규제 시퀀스는 완전히 U3 영역에서 제거됩니다. 이 삭제는 두 LTRs의 transcriptional 불활 성화 결과, 리버스 녹음 후 5 'LTR에 복사됩니다. 플라스미드 pMDLg / pRRE은 구조 단백질 및 역방향 transcriptase를 제공​​ HIV-1 개그 / POL 유전자를 포함합니다. pRSV - 레브 핵의 효율적인 RNA의 수출 RRE에 바인딩 레브 인코딩합니다. pCMV-G는 인코딩HIV-1 유럽 표준안을 대체 소낭성의 구염 바이러스 당단백질 (VSV-G). VSV-G는 벡터의 tropism을 확대하고 ultracentrifugation 13을 통해 집중력이 가능합니다. Vif, Vpr, VPU 및 NEF 포함한 액세서리 단백질을 인코딩 모든 유전자는 패키징 시스템에서 제외됩니다. lentiviral 벡터의 생산과 조작은 재조합 DNA (참여 연구를위한 NIH 가이드라인에 따라 실시되어야 http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf을 ). 개별 기관 생물 및 화학 안전위원회의 승인을 lentiviral 벡터를 사용하기 전에 필요할 수 있습니다. Lentiviral 벡터는 일반적으로 lentiviral 전송 플라스미드 및 벡터 포장에 필요한 단백질을 인코딩 도우미 plasmids 함께 293T 세포의 cotransfection에 의해 생산됩니다. 많은 lentiviral 전송 plasmids와 헬퍼 plasmids은 Addgene, 비에서 구할 수 있습니다비영리 플라스미드 보관함 ( http://www.addgene.org/~~V ). 일부 안정적인 포장 세포 라인 개발하지만, 이러한 시스템은 시간이 14여 덜 유연성과 그들의 포장 효율은 일반적으로 거부, 15을 제공하고 있습니다. 상용 transfection 키트는 transfection 16 높은 효율성을 지원할 수 있지만 대규모 벡터 준비를 위해 매우 비쌉니다. 칼슘 인산염 석출 방법 293T 세포의 효율적인 transfection을 제공하기 때문에 lentiviral 벡터 생산을위한 안정적이고 비용 효과적인 접근 방식을 제공합니다.

이 프로토콜에서는 20 %의 자당 쿠션을 통해 정화 및 ultracentrifugation와 농도이어서 칼슘 인산염 석출 원리에 기반으로 최대 4 plasmids 함께 293T 세포의 cotransfection로 lentiviral 벡터를 생성합니다. 벡터 titers는 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS) 항문에 의해 결정됩니다ysis 또는 실시간 qPCR에 의한. 이 프로토콜의 lentiviral 벡터의 생산과 적정가 구일이 완료됩니다. 우리는 뉴런과 astrocytes를 모두 포함하는 murine neocortical 문화로 이러한 벡터를 transducing의 예를 제공합니다. 우리는 lentiviral 벡터 형질 도입과 CNS의 기본 교양 세포의 세포 유형의 특정 유전자 발현의 높은 효율을 지원하는 것을 보여줍니다.

프로토콜

1. Lentiviral 벡터의 포장

Lentiviral 벡터는 lentiviral 전송 벡터 및 칼슘 인산염 transfection 방법에 의한 293T 세포에 포장에 필요한 다른 plasmids의 cotransfection에 의해 생산됩니다. 우리는이 프로토콜의 10 100-mm 조직 배양 접시를 사용합니다. 그것은 최대 크기를 조정 또는 아래로 응용에 따라 수 있습니다. 293T 세포 라인 10% 태아 소 혈청 (FBS), 100 단위 / ML 페니실린, 37 ° C ~ 100 μg / ML 스트렙토 마이신과 보완, 높은 혈당 (4500 MG / L)로 Dulbecco의 수정된 이글스 매체 (DMEM)에서 관리되고 있습니다 5% CO 2 배양기.

  1. 배지에서 10 100-mm 조직 배양 요리 (3 X 10 6 세포 / 접시)에 30-40%의 합류점에서 종자 293T 세포. 배양기에 세포를 반환합니다.
  2. 20-24 H 문화 후 세포 밀도를 확인하십시오. 세포는 transfection시 약 80 %의 합류해야합니다.
  3. 50 ML 튜브를 준비합니다. 4.4 ML TE79/10 (1 MM TrisHCl, 0.1 MM 추가EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 다음 플라스미드 DNA의 마이너스 총 볼륨 산도 7.9). 100 μg lentiviral 전송 플라스미드 (그림 1), 58 μg pMDLg / pRRE, 31 μg pCMV-G, 25 μg pRSV - 레브 600 μl 2M CaCl 2. 추가 부드럽게 믹스.
  4. 또 다른 50-ML 튜브를 준비합니다. 5 ML 2X HBS를 (0.05 M의 HEPES, 0.28 M NaCl, 1.5 MM이 나 HPO 4, 산도 7.12) 추가합니다.
  5. 10-ML 피펫으로 DNA-CaCl 2 혼합물을 가지고 튜브를 vortexing하면서 dropwise이 X HBS를 포함하는 튜브에 추가합니다.
  6. 30 분 동안 실온 (RT)에서 석출 반응을 유지.
  7. 배양기에서 배양 접시를 제거합니다. vortexing하여 잘 석출 반응을 섞는다. 각 100 mm 접시 함유 세포로 정지 1 ML을 추가합니다. 서스펜션은 부드럽게 접시에있는 매체를 소용돌이 치는 동안 천천히, dropwise 추가해야합니다. 보육 이러한 요리를 반환 5 H로 떠나.
  8. 문화 매체를 제거합니다. 6 MM 나트륨 BU를 포함하는 6 ML 신선한 배지 추가각 요리에 tyrate. 인큐베이터에 문화를 반환합니다. 구조의 형광 기자이있다면 하룻밤 문화 후, 형광 현미경으로 리포터 유전자 발현을 확인합니다. 그것이 유비 쿼터스 발기인 (예 : CMV 프로 모터)에 의해 구동하는 경우 일반적으로, 세포의 80 % 이상은 리포터 유전자를 표현.
  9. 이틀 (40-44 H) transfection 후, 2 개의 50-ML 튜브 (약 30 ML 각 튜브)에 10 요리에서 뜨는 수집합니다. -80 ° C의 냉장고에 뜨는 고정하거나 다음 단계로 이동합니다.

2. 벡터의 농도 및 정화

  1. 원심 갓 표면에 뜨는에서 모든 세포 파편을 제거하는 10 분 동안 900g (2000 RPM 정도)에서 수집된이나 뜨는 해동.
  2. 0.2-μm의 SFCA 주사기 필터로 60 ML 주사기를 부착합니다. 주사기로 50 ML 튜브에서 뜨는을 전송합니다. polyallomer의 원심 관에 뜨는을 필터링합니다.
  3. 5 ML 피펫의 최대 5 ML 20 % 자당을 (PBS에서 준비) 가져가라. 삽입뜨는을 포함하는 원심 분리기 튜브의 바닥에 피펫. 천천히 벡터 뜨는 아래 자당 솔루션을 추가합니다. 다른 튜브의 표면에 뜨는 대해이 단계를 반복합니다.
  4. ° C 4 H에 대한 Beckman SW28 스윙 로터와 11,000 RPM과 4에서 뜨는을 원심 분리기.
  5. 뜨는을 제거합니다. 각각의 원심 분리기 튜브 150 μl 4 % 유당을 (PBS에서 준비) 추가합니다. 알약을 Resuspend.
  6. 모든 원심 분리기 튜브에서 1.5 ML 관에 집중 벡터를 전송합니다. 15 분 동안 얼음 튜브를 남겨주세요.
  7. pipetting하여 벡터 정지를 섞습니다. 1 분 동안 최대 속도 (16,000 천달러 정도)에 microcentrifuge 같이 해요.
  8. 새로운 1.5-ML 관에 뜨는 전송합니다. 20 μl aliquots에 최종 샘플을 나누어 -80 ° C의 냉동고에 그들을 저장.

3. 벡터의 적정

  1. 종자 5 × 10 4 / 잘 10% FBS로 보완 한 ML DMEM 배지에서 12 잘 플레이트의 HT1080 세포의.
  2. overnig 후HT 문화는 잘 하나에서 세포를 세고 휴대폰 번호를 득점.
  3. 문화 매체로 집중 벡터의 5 배 희석 직렬 (및 1:625; 1:125 25 1시 5분, 1) 확인합니다. 별도의 우물 각 희석 벡터의 전 μl 추가합니다. 샘플 정확도를 높이기 위해 중복될 수 있습니다.
  4. 각도 포함하는 벡터와 벡터없이 잘 개를 1 μl 4 밀리그램 / ML Polybrene (Hexadimethrine 브로마이드)를 추가합니다. 부드럽게 판을 흔들어하여 섞는다. 48 H을위한 인큐베이터로 돌아가기.
  5. 세포 배양 우물에서 매체를 제거합니다. PBS로 각 잘 씻으십시오. 세포를 250 μl 1X trypsine-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가합니다. 전지은 (3-5 분) 분리되면, 1 ML 문화 매체를 추가하십시오. pipetting하여 세포를 Resuspend. 1.5 ML의 원심 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
  6. 6 분 동안 900g에서 원심 분리기. 형광 리포터 유전자 (예 : GFP)와 벡터의 경우 FACS 분석을 위해 3.7 단계로 이동합니다. 기자없이 벡터의 경우 실시간 qPCR을 위해 3.8 단계로 이동합니다.
  7. fluo를 포함하는 벡터에 대한rescent 리포터 유전자가 뜨는을 제거하고 PBS에 3.7 %의 포름 알데히드 300 μl로 펠렛을 resuspend. FACS 분석하여 기자 양성 세포의 비율을 결정합니다. titer는 밀리리터 집중 벡터 (TU / ML) 당 형질 도입 단위로 표시됩니다.

figure-protocol-1

예를 들어, 1 X 10 5 세포 25분의 1 μl (0.04 μl) 벡터와 30 %의 세포로 transduced되었다이 기자 긍정적이며, titer가 될 것입니다 :

figure-protocol-2

오직 dilutions 양성 세포의 비율과 titer를 계산하기 위해 추가 벡터의 양을 간의 선형 관계에 빠지지 사용합니다. 최종 titer는 벡터의 적어도 2 개의 다른 양의 transductions에서 얻은 titers의 평균이어야합니다.

  1. 없이 벡터에 대한형광 리포터 유전자는 제조 업체의 프로토콜에 따라 QIAamp DNA와 미니 키트 (Qiagen)를 사용 HT1080 세포의 게놈 DNA를 추출합니다. primers (HIV-1 PBS / PSI 지역 17) 5'-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 '와 5'-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3'로 ABI 프리즘 7000 시퀀스 탐지 시스템 (응용 Biosystems)를 사용하여 게놈 DNA의 벡터 시퀀스를 확대하고, TaqMan 탐침 5 '-식구들-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3'이다. 게놈의 단일 사본 유전자 (2 부 / 셀)입니다 알부민 유전자는 또한 primers 5'-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 '와 5'-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3'로 증폭하고, 프로브 5'-우리 식구들-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-TAMRA-3습니다 '내부 통제 등. 다음의 프로그램 제작의 지시에 따라 96 - 웰 플레이트에 복사 벡터의 번호와 PCR에 의한 알부민을 결정 : 15 초, 50 ° C에서 2 분, 95 ° 10 분, 95의 35주기위한 C ° C와 60 ° C 2 분입니다. 알려진 농도 plasmids의 10 배로 시리얼 dilutions (부로 표현번호) 템플릿 시퀀스도 알려지지 않은 샘플 부량위한 표준 곡선을 작성 증폭되어야 포함하는. titer는 밀리리터 집중 벡터 (IU / ML) 당 통합 단위로 표시됩니다.

figure-protocol-3

4. Neocortical 문화의 형질 도입

뉴런과 glia를 모두 포함하는 Neocortical 문화는 이전 18 설명된대로 두 단계 도금 절차를 사용하여 마우스 cortices에서 준비가되어 있습니다. 14~16일의 태동부터 태아 생쥐에서 얻은 Neocortices는 10% FBS, 24 음 조직 배양 플레이트 20 밀리미터 포도당과 2 밀리미터 글루타민과 함께 보충 MEM에서 이전에 설립 glial 단일층에 도금하고 있습니다.

  1. 시험 관내에 5 일 후에 neoc 10 μm의 사이 토신 arabinoside (ARA-C)을 추가ortical 문화 이외의 연결을 세포 분열을 억제합니다. 문화에게 2 일간 세포를 계속합니다.
  2. 5-10 분 37의 따뜻한 문화 매체 ° C의 물 목욕. 신선한 배지 (물론 500 μl /)로 매체를 포함하는 아라-C를 교체합니다.
  3. 문화, 원하는 방어 (대상 세포의 개수에 벡터 입자의 개수의 비율 감염 다수)를 벡터에 추가합니다. 24 H에 대한 문화를 계속합니다. 우리는 일차 피질 문화에 (대개 5) 1-10의 방어를 사용합니다.
  4. 신선한 매체와 문화 매체를 교체합니다. 문화를 계속합니다. 벡터 구조에서 리포터 유전자가있다면 2 일 형질 도입 후 형광 현미경으로 세포를 확인합니다. 리포터 유전자 발현은 벡터 디자인과 사용 복용량에 따라 형질 도입 후 뉴런 2-7에 표시됩니다.

5. 대표 결과

이 프로토콜 범위 생산된 lentiviral 벡터의 titers 10 8 -10 10 IU / ML, whicH는 시험 관내 및 생체내의 두 CNS의 세포 유형의 다양한 형질 도입에 적합합니다. 표 1과 그림 2는이 프로토콜이 제작한 벡터를 사용하는 대표적인 결과를 보여줍니다. 우리는 transduced 표현 lentiviral 벡터와 murine neocortical 문화를 녹색 형광 단백질 (GFP) synapsin (SYN) 발기인 또는 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP) 프로 모터에 의해 제어. 이레 형질 도입 후, 우리는 각각 안티 NeuN 및 안티 GFAP 항체와 라벨 뉴런과 astrocytes에 immunostaining 수행했습니다. 으로 표 1과 그림. 2A는 뉴런의 90 % (NeuN + 세포)를 통해, synapsin 발기인을 나르는 벡터로 형질 도입 후 특급 GFP없이 astrocytes는 (GFAP + 세포)이 리포터 유전자를 표현. GFAP 발기인은 astrocytes의 약 80 % (GFAP + 세포) expres, 벡터 구조 (그림 2B)에서 사용되는 경우의 GFP, 모든 GFP + 세포 GFAP와 colocalization와 NeuN-라벨 세포의 GFP 표현의 부재에 의해 확인된대로 astrocytes 있습니다. 이러한 결과는 lentiviral 벡터 CNS와 세포에 특정한 유전자 발현에서 세포로 transgenes를 전달하는 매우 효율적인 적절한 발기인이 사용될 때 달성될 수 있도록 보여줍니다.

figure-protocol-4
1 그림. HIV 기반 lentiviral 벡터와 포장 plasmids의 도식 표현은. HIV-1 provirus는 상단에 표시됩니다. 벡터 생산을위한 요소는 네 가지 plasmids으로 구분됩니다. 플라스미드 lentiviral 양도 U3 영역이 사이토 메갈로 바이러스 프로 (CMV) 발기인, 포장 신호 (ψ), RRE 순서, 중앙 polypurine 기관을 (cPPT), 관심있는 유전자 (예로 대체되는 하이브리드 5 'LTR이 포함되어 있습니다 형광등 선택의 발기인과 함께 기자)와 3 'LTR하는CIS 규제 시퀀스는 완전히 U3 영역에서 제거됩니다. pMDLg / pRRE은 CMV 프로 모터의 조절하에 HIV-1의 개그와 폴포트 유전자 및 RRE 시퀀스가​​ 포함되어 있습니다. pRSV - 레브 RSV 프로 모터에 의해 구동 레브의 코딩 순서가 포함되어 있습니다. pCMV-G는 CMV 프로 모터의 조절하에 VSV-G 단백질 유전자가 포함되어 있습니다. PA는 인간 β-globin 유전자의 polyadenylation 신호를 나타냅니다.

figure-protocol-5
그림 2. 마우스 neocortical 혼합 문화의 리포터 유전자의 표현이 세포 유형의 특정 발기인을 나르는 lentiviral 벡터와 transduced. 문화는 LV-SYN-GFP (A) 또는 (b) 방어 5시 LV-GFAP-GFP 벡터와 transduced되었다. 이레 형질 도입 후, 세포가 백신 NeuN 또는 방지 GFAP 항체와 immunostained되었다. 어퍼 패널 GFP 형광을 보여, 중앙 패널은 immunostaining을 표시하고 낮은 패널은 (GFP : 녹색, NeuN 또는 GFAP : 적색) 이미​​지를 병합됩니다.

벡터 뉴런의 GFP + 세포 astrocytes에 GFP +는
LV-SYN-GFP 92.2 ± 7.3 0
LV-GFAP-GFP 0 78.3 ± 11.5

표 1. murine neocortical 문화의 GFP 표현의 비교는 다른 발기인을 나르는 lentiviral 벡터와 transduced.
Murine neocortical 문화는 (5 × 10 5 / 잘 24 - 웰 플레이트) 입니다만 5 시에 LV-SYN-GFP 또는 LV-GFAP-GFP와 transduced되었다. 형질 도입 후 이레가, 문화가 수정 및 NeuN 또는 GFAP에 대한 immunostained되었다. GFP와 NeuN / GFAP 표현하는 세포의 숫자는 실험 조건 지당 10 분야의 이미지에 포함되었다. 값은 또는 뉴런의 비율 (NeuN + 세포)를 나타내는또한 GFP의 리포터 유전자를 표현 astrocytes (GFAP + 세포). 표시된 값은 수단 ± SD 세 독립적인 실험에서입니다.

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토론

이 프로토콜에서는 neocortical 문화권에서 이러한 벡터의 lentiviral 벡터와 응용 프로그램의 제작을 보여주었다. 우리는이 방법으로 생산되는 벡터로 효율적이고 셀 유형 - 특정 형질 도입을 보여주었다. synapsin 모터를 사용하는 경우, GFP 표현은 엄격히 신경 세포에만 적용됩니다. GFAP 모터를 사용하는 경우, GFP 표현은 astrocytes에 독점적이다. 어떤 세포 유형에 특정한 표현이 필요하지 않은 경우 유비 쿼터스 발기인을 사용할 수 있습니다. 우리가 추구하는 neocortical 문화 6에서 높은 수준의 유전자 발현을 운전할 수 ubiqutin 및 phosphoglycerate의 키나제 (PGK)을 찾았습니다. lentiviral 벡터에 의한 유전자 발현은 발기인의 선택 (예 : 유비 쿼터스 또는 형식 고유의 셀)에 의해 또는 특정 조직이나 응용 프로그램을 대상으로 서로 다른 봉투 단백질이나 벡터 pseudotypes를 사용하여 표현하거나 셀 유형의 특정 수준에 맞게 할 수 있...

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공개 사항

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

감사의 글

이 작품은 워싱턴 대학, 프로그램 프로젝트 그랜트 NS032636 (BJS)에 NIH 신경 과학 청사진 코어 교부금 (P30 NS057105, BJS)와 신경계 장애에 대한 희망 센터에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호
DMEM 시그마 - 올드 리치 D5796
MEM Invitrogen 11090-081
태아 소 혈청 Hyclone SV3001403
PBS Mediatech 21-040-CM
트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 시그마 - 올드 리치 T3924
나트륨 butyrate 시그마 - 올드 리치 B5887
Hexadimethrine 브로마이드 (Polybrene) 시그마 - 올드 리치 H9268
293T 세포 ATCC CRL-11268
HT1080 세포 ATCC CCL-121
팔콘 100 X 20mm 조직 cultur전자 요리 BD Biosciences 353,003
× 3 ½ polyallomoer의 원심 분리기 튜브 1 Beckman - 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 326,823
0.2 마이크론 주사기 필터 코닝 431,219
QIAamp DNA 미니 키트 Qiagen 51,304

참고문헌

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