주름 식민지 개발을 사용하여 Biofilm 형성을 평가하기 위해 세미 양적 접근

1. 초기 특성화 및 고려 사항

1. Biofilm 형성은 일반적으로 세포 밀도와 성장 속도에 의해 영향을받습니다. 따라서 성장 속도 (시간에 따른 광학 밀도 (OD)의 증가) 및 단순 성장 곡선과 세포 도금 assays를 수행하여 관심의 변형 (들)의 수율 (최종 휴대폰 번호)를 확인하는 데 필요합니다. 실험을 야생에서 결과를 해석하면 성장, 혹은 OD 및 휴대폰 번호 사이의 상관 관계의 부족 결함은 고려되어야한다.
2. 마이너 판 - 투 - 플레이트 편차가 biofilm 개발에 영향을 수 있으므로 주름 콜로니 형성을 평가했을 때 같은 접시 적절한 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 포함합니다.
3. 스포팅위한 최상의 조건​​, 즉 제어 및 관심있는 돌연변이 (들) 사이의 가장 뚜렷한 차이를 밝혀 이들을 식별합니다. 같은 다른 미디어 또는 온도 등 다양한 조건 하에서 액체 문화의 변종을 재배하고, 다양한 무대에이전에 야생의 성장 (지수 혹은 고정 상)의의. 스팟 10 적절한 미디어를 향해 다양한 세포 밀도의 문화의 μl, 그리고 식민지의 morphologies은 명백한 될 때까지 원하는 온도에 부화.
4. 엔드 포인트 분석 (예, 48 시간) 야생 후 미리 정해진 시점에 주름이 식민지 형성의 평가를 포함한다. 이 평가는 종자 유용 biofilm 형성에 전시 (또는 전시 제안하고 있습니다) 심각한 결함니다.
5. 시간 코스 분석은 일정 기간 (예, 매 시간) 이후의 야생을 통해 주름 식민지 형성을 평가합니다. 이 분석은 일정 기간 동안 주름이 식민지 형성 및 패턴 개발의 시작의 결정을 허용하여 biofilm 형성 세미 양적 평가를 허용합니다. 주어진 시간 코스에 대한 컬렉션 포인트의 실험과 숫자의 기간은 예비 실험에서 결정되어야한다.
6. 쉽게에 설정 후 야생 시간을 추적하려면최대 계산하기 imer.

2. V.에 주름 콜로니의 형태론의 현미경 평가 fischeri

1. 접종 V. LB-소금 (LBS) 중형 ¹³ (1 % [W / V] tryptone, 0.5 % [W / V] 효모 추출물 2 % [W / V] 나트륨 염화물, 50 MM 트리스-HCL [5 ML에 fischeri 세포 산도 7.5]) 28시 야간, 흔들림과 함께 필요한 경우 항생제와 부화를 포함한 ° C. 세포가 원하는 OD _600에 도달하기 전까지 아침에, 동일한 조건 하에서 신선한 LBS 매체와 부화 5 ML에 1:100 희석과 세포를 subculture (예 : OD ₆₀₀ = 0.2 또는 0.5).
2. microfuge 튜브와 하나 잠깐 최대 속도 microfuge 세트의 원심 분리기로 문화의 피펫 1 ML. 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다. 멸균 70% 인공 해수 중 1 ML (ASW) (35 MM MgSO ₄ 7H ₂ O, 7 MM CaCl에 펠렛을 resuspending하여 잔류 미디어 및 세포외 구성 요소를 제거하는 세포를 씻으2 - 2 시간 ₂ O, 210 MM NaCl, 7 MM KCl)과 원심 분리를 반복. 70% ASW 1 ML에서 한물간 펠렛을 Resuspend.
3. 각 예제와 같은 600 nm의에서 OD가 추정 세포의 동일한 숫자를 포함하고 있는지 확인합니다. 추가 70% ASW보다 집중적으로 샘플을 diluting하여 필요한 조정을합니다. 예비 실험에서 다양한 초기 OD 값의 현장 문화는 변종이나 조건의 주어진 집합에 대한 최적의 시작 OD를 확인하십시오. 최상의 결과 V. 위해 얻을 수있다 반점은 약 0.2의 OD와 문화에서 생성됩니다 fischeri.
4. 필요한 경우 항생제를 포함한 LBS 플레이트쪽으로 한물간 세포의 10 μl를 정확 해요. 접시에 문화를 안보 때, 한천 표면 위에서 꾸준한 피펫 (손가락 포함)에 있는지 확인하십시오. 아니 각도로, 수직으로 정확하고, 현장의 균일한 분포를 위해 천천히 액체를 추출. 일반적으로 각 변형이 (접시 당 최대 6 곳) 접시에 한 번씩 목격되고 위트실험마다 H 여러 접시 (2-3).
5. 점박이 문화가 고르게 분산 상태를 유지하기 위해 자리가 인큐베이터에 플레이트를 이동하기 전에 건조하실 수 있습니다. 번호판을 반전 28에서 그들을 품어 ° C.
6. 접종에 따라 12~15시간에서 성장하고 자리 시간별 시작의 형태를 모니터링합니다. 우리는 카메라 첨부 (ProgRES C10 ^{플러스)와} ProgRes CapturePro하고 관찰하고 문서화 식민지의 형태를하고 주름 식민지 형성의 시작과 진행을 평가하기 위해 ImageJ 소프트웨어 프로그램과 함께 해부 범위 (자이스 혈구 stemi 2000-C)을 사용합니다.
7. 이미지 위에서 캡처하는 동안 단계 2.5에 나열된 특정 설치의 경우 반점은 CL 1,500 EC 차가운 광원과 투명한 유리 단계를 통해 수렁에서 조명하고 있습니다. 이 설정은 영상 주름 식민지 개발을위한 이유 V. 최적입니다 fischeri 식민지는 (명소) 반투명입니다.
8. 세인트에 나열된 특정 장비의 부재에EP 2.5, 완전한 식민지 시청 가능하며 조절 광원과, 이상적으로, 연결된 카메라를 가지고있는 해부 현미경을 사용하여 모니터 주름 식민지의 형태. 필요한 경우, 디지털 카메라도 첨부된 카메라의 부재로 활용하지만 이것은 최적되지 않습니다 수 있습니다.
9. 최고의 주름 식민지 개발을 시각화하기 위해서는 개발 biofilms의 입체 형태가 분별이 될 수 있도록 세균성 식민지 밑에 반사의 조명 강도와 각도를 모두 조정할 필요가 있습니다. 발견 식민지와 식민지의 아키텍처 (주름) 명확히 구별할 수 있는지 등 주변의 한천 배경 사이의 강한 대비를 제공하는 최적의 조명 조건을 확인합니다.
10. 식민지 색상의 변경이 biofilm 형성하는 동안 발생할 수있는 경우에 반점이 식민지의 색상 또한 고려되어야한다. 표시하는 방법으로 조명 소스의 강도와 각도를 조정착색에 이러한 미묘한 변화. 적절한 설정이 달성되면, 실험 기간 동안 그들을 유지합니다.
11. 얼마나 시간이 경과 접종시기부터 주름이 군락 형성이 각 변형이나 컨디션에 시작되는 시간이 있습니다. patterning 및 3D 구조의 형성 (즉, 강선은 바깥쪽 가장자리에 형성 또는 '파문'는 중앙에 발생)가 없었던 이유는 첫째되는 시점으로 주름 식민지 형성의 시작을 정의합니다. 돌연변이 세포는 주름 식민지 형성의 시작 (예를 들어, 그림 2.)로 시간을 감소 또는 증가 발생할 수 있습니다.
12. 적절한 디지털 이미지를 캡처하여 주름 식민지 형성의 시작과 발전을 문서. 그것은 실험을하는 동안 이미지를 수집하는 경우 동일한 배율을 사용하는 것이 중요합니다. 현미경의 접안 렌즈에서 카메라의 후면에 위치한 레버를 사용하여 컴퓨터 화면으로보기를 전환합니다. 접안 렌즈 사이를 전환할 때그리고 컴퓨터 화면 시청은 전망을 조정하고 이에 따라 초점을 맞춥니다.
13. 이미징 점박이 배양하기 전에, 페트리 접시의 뚜껑은 일반적으로 가장 선명한 이미지를 제공하기 위해 제거됩니다. 점박이 문화가 단계 2.5 및 2.6에서 설명한 설정을 사용하여 뚜껑을 통해 몇 군데 수 있습니다 그러나, 이것이 단계는 선택 사항입니다.
14. 주름 식민지 형성의 시작에 따라 각각의 시점에서, 주름 식민지 개발의 패턴을 확인합니다. 아키텍처는 내부 밖에서 개발할 수도 있고,이 평가 인치 외부는 다른 변종이나 다른 조건 하에서 형성 biofilms를 구별하기위한 메커니즘을 제공합니다.
15. 각 시점에서 개발 식민지의 직경을 측정합니다. 이것은 수동으로 수행하거나, 디지털 관련 소프트웨어 프로그램을 사용하실 수 있습니다. 디지털로 할 경우, ProgRes CapturePro 소프트웨어 프로그램을 사용하여 먼저 실험에 사용된 특정 배율로 눈금 막대를 보정. 캡처된 각각의 이미지의 스케일 막대를 포함합니다.
16. ImageJ 소프트웨어 프로그램을 사용하여 식민지 직경을 계산하려면 각 이미지 파일을 엽니다. 다음과 같이 규모가 막대를 표준화 : 도구 모음에서 '스트레이트 라인 옵션 "을 선택하십시오. 동일한 길이와 너비 직선으로 임베디드 규모 표시줄을 입혀라. 레이블 탭에서 "설정 규모"를 선택 "분석을." 그리고 "확인"을 선택, "알려진 거리"상자에서 (즉, 2mm로서 원래의 규모 표시줄에서 결정) 해당 길이를 넣습니다.
17. 현장을 가로질러 수평선을 삽입하려면 '스트레이트 라인'옵션을 사용하십시오. 분석 탭에서 "법안"을 선택합니다. 새로운 결과 창에서 계산된 길이가 제공됩니다. 현장 전반에 걸쳐 수직 라인을 삽입하여 두 번째 측정을 구합니다. 직경을 다시 계산합니다. 두 측정의 평균을 기록합니다. 그래프와 같은 엑셀과 같은 소프트웨어 프로그램을 사용하여 각 시점에서 각 지점의 평균 직경.
18. 실험의 끝이 어느 특정 시점에서 때 또는 더 이상 없습니다 발생biofilm을 개발. 끝에 도달하면, 같은 파워 포인트와 같은 소프트웨어 프로그램을 사용하여 시간이 지남에 따라 패턴 개발을 시각화하기 위해 그림 (들)에 이미지를 통합.

3. 대표 결과

이러한 실험에서는 사용 V. 고체 한천 표면에 주름이 식민지의 발전을 평가하여 biofilm 형성을 연구하는 모델 생물로서 fischeri. V.의 Biofilm 생산 종자 40 H 내에서 광범위한 3D 아키텍처 fischeri 양식 식민지 (그림 1) ^8,9,14. 시간에 걸쳐 검사하면 컨트롤 변형에 의한 주름 식민지 형성이 12만큼 일찍 시작하는 것이 명백한된다 H 포스트 접종 (특정 조건에 따라 다름) (그림 2) ^9. 반대로, 대표적인 돌연변이에 의한 biofilm 형성은 약 16 H 포스트 접종 ^9까지 시작하지, 약 4 H에 의해 지연될 수 있습니다. 반복 하오이러한 실험 TS는 ^9이 평가는 세미 양적 만드는시기가 비교적 일관성 것을 제안했습니다. biofilm 형성의 두 번째 세미 양적 측정은 시간이 지남에 개발 식민지의 직경의 변화 이용한다. 다른 이름으로 그림. 3A는 대표 biofilm - 관할 발표했던 식민지를 형성하는 그 복잡 성과 biofilms을 구성하지 못하는 대표적인 변형에 상대적으로 직경이 증가. 이 두 가지 변종에 의해 형성된 콜로니 직경의 시간의 경과에 조심스럽게 측정은 biofilm-관할 콜로니의 크기가 biofilm - 부정적인 식민지보다 더 큰 비율로 증가 것으로 나타났다 및 종료 시점에 두 사람은 거의 2 일까지 다릅니다 - 배 (그림 3B). 대표 늦은 시간 또는 "엔드 포인트"식민지의 형태의 이미지가 자주 문학에 표시된 있지만 따라서, 추가, 세미 양적 데이터는 biofilm 결함에 대한 이해를 허용할 것이다 수령하실 수 있습니다.

그림 1. 엔드 포인트 분석. 이 수치는 V. 대표 (오른쪽) 이외의 biofilm - 성형 (왼쪽)와 biofilm - 성형 변종을 사용하여 엔드 포인트 분석의 예입니다 fischeri. 이러한 이미지는 40 H는 이후 야생에서 수집되었다. 이러한 이미지는 야생 형 V.으로 생성되었습니다 fischeri는 벡터 제어 (비 biofilm - 성형) 또는 설정 모리스 외., 2011에 대해 수집된 데이터의 rscS overexpressing 플라스미드 (biofilm - 성형) 및있었습니다 일부를 포함하는.

그림 2. 시간 코스 분석. 상단 패널의 biofilm - 유능한 제어의 흐름은 biofilm 형성을 대표하는 이미지가 포함되어 있습니다 V. 선택한 시간 코스 이상 fischeri. biofilm 형성의 개시는 12 H에 분명하다. 하단 패널은 대표 전을 포함V.의 돌연변이 변종의 mages biofilm 형성 16 H 이후의 접종시 시작으로 시간이 지남에 주름이 식민지 형성의 시작의 지연 (4 H), 전시 fischeri. 이러한 변종 사이의 미묘한 차이가 오직 이전 시간 지점에서 관찰하는 동안 40시간에서 변종이 biofilm 형성의 강도 및 patterning에서 비슷합니다. 이러한 이미지는 rscS overexpressing 야생 - 타입과 sypE 돌연변이로 생성된 V. fischeri 세포와 데이터의 줄 부분은 모리스 외 대해 수집된 집합., 2011.

biofilm 형성의 반 정량 분석 그림 3. 콜로니 직경. V. 대표 biofilm - 성형 (위쪽 패널) 및 비 biofilm - 성형 (하단 패널) 변종에 의한 biofilm 형성 () 시간 코스 fischeri. biofilm - 성형 변형률이 큰 증가를 전시하고주의비 biofilm 형성 변형에 상대적으로 시간이 지남에 직경 인치 이러한 이미지는 야생 형 V.으로 생성되었습니다 데이터 rscS overexpressing 플라스미드 (biofilm - 성형) 또는 벡터 제어 (비 biofilm - 성형) 및있었습니다 부분을 포함 fischeri 모리스 외., 2011에 대한 수집 설정합니다. (B) 프로토콜에 명시된 바와 같이 이러한 데이터가 ImageJ와 엑셀 소프트웨어를 사용하여 생성된 패널 A에서 두 변종에 의해 시간의 경과에 식민지 직경의 증가의 그래픽 표현.

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.