우리 프로토콜이 정상적으로 쉽게 생쥐의 신장에 따라 캡슐 아일 레츠이나 세포를 제공하기 위해 개발되었습니다. 세포 신장 캡슐에서 세포를 이식에 사용되는 최종 튜브에 쥐똥에 집중되어있다. 이 기법의 용이성은 세포와 마우스에 스트레스를 줄여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
우리 프로토콜이 정상적으로 쉽게 당뇨병이나 정상적인 생쥐의 신장에 따라 캡슐 아일 레츠이나 세포를 제공하기 위해 개발되었습니다. 우리는 신장 캡슐에서 세포를 이식하는 데 사용되는 최종 배달 튜브 (PE50)에 쥐똥에 아일 레츠이나 세포를 집중하는 것이 더 쉽습 것으로 나타났습니다. 세포 또는 마우스 어떠한 부당한 스트레스를 줄이는 한편이 기술은 속도와 편의를 모두 제공합니다.
로딩 : 해결 된거 같고, 손이 아일 레츠 또는 pelleted 세포 신중하게 p200 pipetteman와 스트레이트, 얇은 벽을 피펫 팁을 사용하여 1.5 ML의 microcentrifuge 관의 하단을 aspirated있다 골랐어요. PE50 관의 길이는 작은 실리콘 어댑터 튜브를 사용하여 피펫 팁에 첨부되어 있습니다. 세포 팁에 정착하고, 다음 천천히 pipetteman를 다이얼링하여 PE50 튜브로 전송됩니다 허용됩니다. 세포 PE50 튜브의 끝에 가까이되면, 꼬임이 만들어이며 실리콘 어댑터 튜브는 꼬임을 통해 배치됩니다. PE50 관은 15 ML 포함 원뿔 절단 5 ML의 pipet로 전송되며, PE50 튜브는 centrifuging 동안 컬링 방지하기 위해 5 ML의 pipet의 측면 지워졌을 것입니다. 전지는 1,000 RPM에 도달 허용하고 중지합니다.
이식 :받는 사람의 쥐가 anesthetized 있으며, 면도하고, 청소. 작은 절개는 마우스의 좌측에서 만들어이며 신장이 노출됩니다. 신장, 지방, 그리고 조직은 정상적인 생리와 젖은 면봉 보관됩니다. PE50의 말초 끝은 실리콘 어댑터 튜브를 사용하여, 피펫 팁을 포함, 해밀턴 스크류 드라이브 주사기에 첨부되어 있습니다. 작은 별명은 큰하거나 너무 깊이도 아니라, 신장의 오른쪽 측면 사이드에 이루어집니다. PE50 관의 beveled 끝은 세포 가까운 조심스럽게 캡슐 아래에 위치, 튜브는 정상적인 생리를 보라고하면서 공간을 만들기 위해 부드럽게 주위에 이동, 건조 캡슐 쉽게 눈물하실 수 있습니다. 작은 공기 방울이 서서히 주사기 스크류 드라이브를 다이얼링하여 캡슐에 따라 제공됩니다. 아일 레츠 그런 다음 천천히 기포 뒤에 전달됩니다. 일단 아일 레츠가 배달되었습니다 신장 항상성 유지되고 장식용은 낮은 열로 불로 지졌죠 있습니다. 신장은 구멍으로 다시 배치되고 복막과 피부 봉합하고 잘라입니다. 마우스 즉시 Flunixin와 Buprenorphine 평방 대우 및 난방 패드에있는 새장에 배치됩니다.
프로토콜
이식 아일 레츠의 준비 (TX)
- 거꾸로 현미경, P200 pipetman와 100mm 접시에 교양 아일 레츠에서 바로 pipet 팁을 사용하여 직접 선택할 아일 레츠.
- 카운트는 각 microcentrifuge 관 (~ 500 아일 레츠 / 튜브 / 마우스)로 시간과 전송에 100 아일 레츠.
- 아일 레츠는 microcentrifuge 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다.
- 스트레이트 얇은 벽을 pipet 팁을 사용하여 P200 pipetman (130ul에서 설정) 하나의 아일릿 펠렛을 그립니다.
- 주사기 팁 통해 실리콘 튜브 어댑터를 넣으십시오. 실리콘 어댑터에 PE50 튜브의 길이를 넣습니다.
- 팁에서 아일 레츠보다 후드 벽에 PE50 튜브 높은 후드와 테이프의 측면에 pipetman을 만요. 이것은 아일 레츠는 피펫의 팁을에 정착하실 수 있습니다.
- 천천히 끝에서 아일 레츠를 추방하지 pipetman를 다이얼링하고 PE50 튜브로 아일 레츠 이동, 조심 됨으로써 PE50 튜브로 아일 레츠를 전송합니다.
- PE50 관의 beveled 결국 꼬임을 만듭니다. 꼬임을 유지하면서, pipetman에서 실리콘 어댑터 튜브를 분리하고 실리콘 어댑터와 꼬임을 확보.....
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토론
이 프로토콜은 깔끔하게 쉽게 당뇨병이나 정상적인 생쥐의 신장에 따라 캡슐 아일 레츠이나 세포를 전달하기위한 실용적이고 효율적인 옵션을 제공합니다. 신장 캡슐에서 세포를 이식하는 데 사용되는 최종 배달 튜브 (PE50)로 아일 레츠이나 세포를 집중하고 pelleting의 기술은 세포 또는 마우스 어떠한 부당한 스트레스를 줄이면서 세포를 이식의 간단하고 효과적인 방법을 제공합니다.
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감사의 글
UCSF 당뇨병 센터. NIH UCSF DERC 아일릿 코어. JDRF. LIfeScan 주식 회사 존슨 앤 존슨 회사입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 수술용 장갑 | Fisher Scientific | 11-394-95(sz) | |
| 수술용 세척 스펀지 | Moore Medical | 42940AK | |
| 포셉 | Miltex Inc. | 6-114 및 6-26 | 치형 2개, 직선형 2개 |
| 해부용 가위 n=2 | Miltex Inc. | 5-290 | |
| Oster 면도기 (40번 칼날) | Fisher Scientific | 01-305-10B | |
| 4x4 멸균 거즈 패드 | Moore Medical | 08252AK | |
| 포비돈 요오드 패드 | Moore Medical | 08486AK | |
| 알코올 패드 | Fisher Scientific | 14-819-2 | |
| 가열 패드 | Moore Medical | 42508AK | |
| 23G 또는 25G 바늘 | 길이 1" | ||
| Cidex 용액 | Moore Medical | 07535AK | 기구 세척/소독용 |
| PE50 폴리에틸렌 튜브 | BD Biosciences | 427411 | PE50, 외경 0.965mm x 내경 0.58mm |
| Cidex + 28일 용액 | Moore Medical | 35625AK | |
| 실리콘 튜브 | Spectrum Chromat. | 123732 | 외경 5/32” x 내경 1/32” |
| 기구 멸균 용기 | Moore Medical | 39074AK | |
| 직선형 피펫 팁 | USA Scientific, Inc. | 1111-0810 | 멸균 |
| 스크류 구동식 유리 주사기 | Hamilton Co | 1001 | |
| 소작기 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS230 | |
| 지침기로 | Moore Medical | 41-067 | |
| 5-0 실크 | LOOK Surgical | 754B | 봉합용 (6-C) |
| 면봉 | Moore Medical | ||
| 9mm autoclip 스테이플러 | BD Biosciences | 7630 | |
| 9mm 스테이플 | BD Biosciences | 7631 | |
| 9mm 스테이플 제거기 | BD Biosciences | 7637 |
참고문헌
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A.
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