신경 회로는 topographically 특정 분자 프로필과 기능적 구획으로 구성되어 있습니다. 여기서는 다양한 wholemount immunohistochemical 염색법 접근 방식을 사용하여 글로벌 뇌의 지형을 드러내는을위한 실용적이고 기술적인 단계를 제공합니다. 우리는 잘 이해 cytoarchitecture과 소뇌의 회로를 사용하는 방법의 유틸리티를 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
소뇌의 반복이고 잘 이해 셀룰러 아키텍처는 뇌의 지형을 탐험하는 데 이상적인 모델 시스템을 확인합니다. 그것의 비교적 균일한 cytoarchitecture 밑에는 유전자 및 단백질 표현의 parasagittal 도메인의 복잡한 배열입니다. 소뇌의 분자 compartmentalization는 수입 성의 섬유의 해부 학적 및 기능적 조직 피지만. 완전히 소뇌 조직의 복잡도를 감사하기 위해 우리는 이전에 마우스 소뇌의 patterning 결함의 높은 처리량 분석을위한 wholemount 염색법 방식을 정제. 이 프로토콜은 상세히 시약, 도구 및 성공적 wholemount immunostaining를 사용하여 성인 마우스 소뇌에서 단백질 발현 패턴을 표시하는 방법으로 유용 실용적인 단계를 설명합니다. 단계는 여기에서 뇌의 미세 지형이 그 드러날 수있는 방법의 예로 zebrinII / aldolaseC의 표현을 사용하여이 방법의 유틸리티를 입증 강조네이티브 입체 형태. 또한 설명은 분자 지형의 비교 연구를위한 수입 성의 전망 및 대형 cerebella의 단백질 표현의 시각화 수 있도록 프로토콜에 adaptations 있습니다. 이러한 응용 프로그램을 설명하기 위해 쥐의 소뇌의 수입 성의 염색법의 데이터가 포함되어 있습니다.
프로토콜
1. 동물 재관류와 소뇌의 해부
- 단백질에 따라 관류는 성공적인 염색법의 1,2에 필수적인 것입니다. Transcardiac 재관류는 anesthetics의 적절한 사용을 필요로 침입이 아닌 생존 절차입니다. 올바른 교육 기관 승인 및 IACUC 승인 모든 절차를 시도하기 전에 필요합니다. 항상 실험적인 요구 사항을 식별하고 올바른 교육을 습득에 도움을받을 기관의 수의사와 상담하는 것이 좋습니다. 절차 전에 동물 깊이 anesthetized 등 도보 또는 꼬리 핀치와 같은 자극에 반응하지 있어야합니다. 이용 가위는 복부 피부와 근육 벽에 상처를 만들고 다음 각 측면에 흉골에 단지 인접 절단하여 흉곽을 열 것을 계속한다. 또한, 실험자들은 다이어프램을 둘러싼 근막을 절단하여 큰 내부 작업 공간을 만들 수 있습니다. 복부 및 흉부 벽 superio 운동으로rly, 심장이 지금 노출됩니다. 밖으로 흘러 즉시 좌심실로 관류 바늘을 삽입하기 위해 혈액을 허용하도록 오른쪽 중앙홀에 작은 절개를합니다. 기본 정압 펌프는 (자세한 내용은 표 1 참조) 재관류 솔루션을 제공하는 것을 추천한다. 첫째, 0.1M 인산과 혈액을 끌어낼 유체 분명히 실행까지 (PBS, 표 3 참조) 염분 버퍼. 그런 다음, 정압 펌....
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토론
우리는 개발과 성인 두뇌의 의미 심장한 단백질 발현을위한 다목적 immunohistochemical 접근법을 사용해서 성공 wholemount의 염색법에 필요한 기술적인 세부 사항을 설명했습니다. 이 접근법을 사용하여 복잡한 분자 발현 패턴 분석 수 있으며 뇌 지형이 힘드는 시간이 소요되는 조직 sectioning 절차없이 평가.
이 프로토콜은 성인 1,2,8,9 및 조기 출생 후의 마우스 소뇌 10,11,12 모두에서 여러 Purkinje 세포 단백질의 패턴 표현식을 나타내기 위해 사용되었습니다. 우리의 원래의 연구는 또한 세분화된 레이어 pial 지표면 아래 ~ 250 μm의를 상주 과립 세포 항원 표현 1과 anterogradely 추적 이끼 낀 섬유 2, 검사를위한 wholemount 접근 방식의 유틸리티를 보여주었다. 또한, 여러 연구는 단백질의 성공적인 염색법을 위해 원래의 프로토콜에 수.......
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공개 사항
우리는 공개 할게 없다.
감사의 글
RVS는 예시바 대학 의과 알버트 아인슈타인 대학에서 창업 자금을 새로운 조사에 의해 지원됩니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 자료 | 프로토콜의 기능 | ||
| 관류 펌프 (피셔 Scientific/13-876-2) | 일관성 있고 느린 재관류을 허용합니다. | ||
| 샤프 - 팁 가위 (FST/14081-08) | 관류 및 해부의 일반 사용합니다. | ||
| 무딘 물체 팁 포셉 (FST/91100-12) | 재관류 바늘의 삽입에 대한 마음을 안정합니다. | ||
| 집게 (뒤몽 AA/11210-10 의한 FST) | 두개골에서 뇌의 해부 중에 사용과 두뇌의 나머지 부분에서 소뇌를 분리. 그들은 해부 동안 소뇌의 손상을 최소화하는 데 도움이 약간 둥근 팁을 가지고 있기 때문에 이들은 필수적입니다. | ||
| Nutator (피셔 과학) | 인큐베이션 기간 동안 운동에 조직을 유지하는 데 사용됩니다. | ||
| 1.5 ML 튜브 (Sarstedt / 스크류 캡 마이크로 튜브) | 자신의 모든 단계tochemistry 프로토콜이 microtubes에서 열립니다. 둥근 바닥은 소뇌는 운동으로 유지한다는 보장합니다. | ||
| 다공 스푼 (FST/10370-17) | 부드럽게 보냈다 솔루션을 decanting 동안 microtubes에 wholemounts을 유지하는 데 사용됩니다. | ||
| Leica MZ16 FA 현미경 | wholemount 염색법을 검사하는 데 사용됩니다. | ||
| Leica DFC3000 FX 카메라 | wholemount 이미지를 캡처하는 데 사용됩니다. |
표 1.
| 전형 wholemount 실험에 대한 예제 달력 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 일 | 덴트의 수정, 실온 8 시간 | 덴트의 표백제, 4 ° C, 하룻밤 | ||||||
| 날 2 | 백퍼센트 MeOH, 실내 온도, 배, 30 분 각각 | 100 % MeOH, 프리즈 / 해동, 4X, 30 min/15 분 | N = "2"> 100 % MeOH, -80 ° C, 하룻밤 | |||||
| 3 일 | 50% MeOH/50 % PBS, 실온, 60-90 분 | 15% MeOH / 85% PBS, 실온, 60-90 분 | 백퍼센트 PBS, 실온, 60-90 분 | PBS의 10μg/mL Proteinase K, 실내 온도, 2-3 분 | 배 백퍼센트 PBS, 실온, 10 분 각각 | 하룻밤 PMT, 4 ° C, | ||
| 일 4-5 | PMT + 1 ° 항체 + 5퍼센트 DMSO, 4 ° C, 48 시간 | |||||||
| 6 일 | PMT, 4 ° C, 2 - 3 배, 2-3 시간마다 | PMT + 2 ° 항체 + 5퍼센트 DMSO, 4 ° C, 24 시간 (또는 ABC 복잡한와 증폭 단계를 시작합니다) | ||||||
| 7 일 | PMT, 4 ° C, 2 - 3 배, 2-3 시간마다 | PBT, 실온, 2 시간 | 최적의 염색법이 시각까지 PBS에서 신선한 DAB에 품어 | |||||
| 조리법은 (* = 매번 신선한 준비) | |
|---|---|
| PBS (인산염은 염분 버퍼) | 0.1M 인산염은 탈이온수에 염분 버퍼. 산도 7.2 (시그마 정제, P4417) |
| PFA (Paraformaldehyde) | 제작 및 저장 작업 솔루션을 PBS 4 %로 희석 후 20 %의 솔루션으로 동결하고 (; T353 피셔 과학) |
| 덴트의 정착액 3 * | 4 개로 메탄올 한 부분 dimethylsulfoxide (DMSO, 피셔 과학, D159-4) |
| 덴트의 블리치 3 * | 4 개로 메탄올 한 부분 dimethylsulfoxide (DMSO, 피셔 과학, D159-4) 한 부분은 30 % 과산화수소 |
| 효소 소화 | 10 μg / Proteinase K (로슈 진단, 03,115,828,001)의 ML PBS 인치 |
| PBST | PBS 포함 : 0.1 % 십대 초반-20 (FisheR 과학, BP337, 트리톤은 모든 인스턴스에서 십대 초반-20 대신에도 사용할 수 있습니다.) |
| PMT는 25 * | PBS 포함 : 2퍼센트 무지방 탈지 우유 분말 (카네이션은 우대) 0.1 % 십대 초반-20 (피셔 과학, BP337) |
| PBT 25 * | PBS 포함 : 0.2 % 소 혈청 알부민 (시그마; B9001S) 0.1 % 십대 초반-20 (피셔 과학, BP337) |
| DAB * | PBS의 40 ML에서, 3,3-diaminobenzidine 중 10 밀리그램 정제 (D5905 시그마 - 올드 리치)를 해산. ) 반응을 촉진시키기 위해서 30 % 과산화수소 10 μl를 추가합니다. |
| ABC 복합 솔루션 | Vectastain 키트 (벡터 실험실, INC, PK-4000) |
표 3.
참고문헌
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount Immunohistochemistry: A high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. J. Histochem. Cytochem. 50, 235-244 (2002).
- Kim, S. -H., Che, P., Chung, S. -H., Doorn, D., Hoy, M., Larouche, M., Marzban, H., Sarna, J., Zahedi, S., Hawkes, R.
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재인쇄 및 허가
