방법 논문

단일 Oocyte의 Bisulfite의 돌연변이 유발

DOI:

10.3791/4046

⸱

2012년 6월 27일

 ,  , 
1Department of Obstretrics & Gynaecology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2Department of Biochemistry, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 3Children's Health Research Institute

이 논문에서

요약

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Bisulfite의 돌연변이 유발이의 DNA methylation 분석을위한 황금 표준입니다. 우리 수정된 프로토콜은 단일 세포 수준에서 DNA의 methylation 분석을 허용하고 특별히 개별 oocytes를 위해 설계되었습니다. 또한 절단 단 배아 사용할 수 있습니다.

초록

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Epigenetics는 모든 물려 전할 수있는 포괄하고 가역 개조 따라서 신 유전자 접근하고,이 유전자 전사 1 규제의 기본 메커니즘임을 염색질합니다. DNA의 methylation은 억압 마르크로 주로 역할을 epigenetic 변형입니다. CPG dinucleotides의 cytosines 향해 메틸 그룹의 공유 결합 외에도 통해 그것은 염색질을 응축하고 유전자에게 2를 입을 관련된 프로세스를 시작하기 위해 추가적인 억압 단백질과 히스톤 수정을 모집할 수 있습니다. 그것이 발달 프로그래밍, 세포 분화, retroviral 요소의 억압, X 염색체 불활 성화 및 게놈 각인에 중요한 역할을 담당으로 DNA의 methylation은 정상 개발을 위해 필수적입니다.

의 DNA methylation 분석을위한 가장 강력한 방법 중 하나는 bisulfite의 돌연변이 유발됩니다. 나트륨 bisulfite은 uracils로 cytosines을 deaminates의 DNA mutagen입니다. PCR 증폭 및 seque 따라 ncing는 이러한 변환 이벤트가 thymines으로 감지됩니다. Methylated cytosines는 deamination로부터 보호하기 때문에 각각의 뉴클레오 티드 수준 3에서 DNA의 methylation의 식별을 가능하게, cytosines로 남아있다. bisulfite의 돌연변이 유발 분석의 개발은 원래보다 민감한 및 7 재현할 수있는 것들을 향해 4-6을보고 그에서 고급했다. 하나의 주요 발전은이를 거친 bisulfite 처리 8 일부터 DNA를 보호, 아가로 오스 비드에 DNA의 작은 금액을 삽입했습니다. 이 활성화된 methylation 분석은 oocytes와 blastocyst 단계의 배아 9 수영장에서 수행해야합니다. 날짜까지 가장 정교한 bisulfite의 돌연변이 유발 프로토콜은 개별 blastocyst 단계의 배아 10입니다. blastocysts은 평균 64 셀 (게놈의 DNA 120-720 PG를 포함하는)을 가지고 있기 때문에 그러나이 방법은 개별 oocytes 또는 절단 단 배아의 methylation 연구를위한 효과되지 않습니다. 십t "> oocytes 11 포함해 분의 DNA 양의 아가로 오스의 삽입에서 단서를 타고, 우리가 oocytes 직접 아가로 오스와 용해 용액 비드 후 즉시 검색하고 oocyte에서 조나 pellucida의 제거에 포함된 약자 방법을 제시한다. 이것은 우리에게 수 두 개의 단일 oocyte의 bisulfite의 돌연변이 유발의 주요 과제 우회 :. 열화로부터 DNA를 분 양을 보호하고, 다양한 프로토콜 단계 동안 후속 손실 데이터가 단일 oocytes에서 얻은 때 중요한 것은,, 수영장 이내 PCR 바이어스의 문제가 제거되고 더 나아가. 하나 이상 methylation 패턴과 아무런 샘플이 분석 12 대상에서 제외되므로 부주의 적운 세포 오염.이 방법에 의해 감지가이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 DNA의 methylation의 성공과 재현성 분석을위한 향상된 방법을 제공하고 이상적으로 적합합니다 개별 oocytes뿐만 아니라 절단 - 무대 배아입니다.

프로토콜

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1 일

이러한 GIBCO 물 등의 살균, 증류수로 oocyte 컬렉션 당일 신선한 다음과 같은 솔루션을 준비합니다. 유전자 오염의 가능성을 줄이기 위해 종종 장갑을 변경하고 필터 팁을 사용합니다. 언제 오픈 튜브 멀리 각도 유지하고, 사용하지 않을 때 모든 튜브를 요점을 되풀이하다. 우리는 솔루션 N +1로 만들어진 것이 좋습니다.

3퍼센트 LMP 아가로 오스

30 MG 낮은 융점 (LMP) 아가로 오스
최대 1 ML GIBCO H 2 O로
@ 70 용해 ° C

용해 용액

8 μl 용해 완충액
1 μl proteinase K
1 μl 10 % IGEPAL
사용할 준비까지 얼음 곳

2시 1분 아가로 오스 : 용해 용액은 (개인 oocyte 당 10 μl, 금액은 3 oocytes입니다)

20 μl 3퍼센트 LMP 아가로 오스
10 μl 용해 용액
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토론

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이것은 하나의 oocyte 분석이 중요하고 특별한주의를 필요로 번호가 많은 단계가 있습니다. 첫 번째는 oocyte 세척이다. 그것은 가능한 많은 적운 세포로 제거하는 hyaluronidase 치료에 따라 drops 새로운 매체의 각 oocyte 여러 번 씻어 특히 중요합니다. 또한, 조나 pellucida 제거를위한 산성 tyrode의 솔루션으로 oocytes를 전송할 때하는 것은 매체를 둘러싼 것은 적운 세포의 명확한지 확인하십시오. oocyte는 조나 제거에 따라 매우 끈적이고, 모든 주변 적운 세포 쉽게 oocyte에 붙어 될 수 있습니다. 그것은 조나 프리 oocyte에 붙어있는 적운 세포를 제거하는 것은 매우 어렵습니다. 이 프로토콜은 나중에 지점에 적운 세포 오염의 검출을 허용하지만, 그것은 가능성이 폐기됩니다 oocytes에서 전체 프로토콜을 받아야하는 건설하거나 경제적으로하지 않습니다.

두 번째 중요한 단계는 oocyte의 삽입이다. 아가로 오스와 LYS에서 .......

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공개 사항

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저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

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이 작품은 웨스턴 온타리오, 산과학 및 Gynaecology학과의 대학에 의해 지원되었다; 및 Ministryof 연구 및 혁신, 조기 연구원 상으로부터 보조금 ER06-02-188. MMD는 복제, 조기 개발 및 보건 (REDIH) 대학원 장학금에 미치는 영향에 CIHR 교육 프로그램에 의해 지원되었다.

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재료

특정 시약 및 장비의 표.

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 댓글
Oocyte 컬렉션
Hyaluronidase 시그마 H4272
산성 Tyrode 시그마 T1788
Proteinase K 시그마 P5568
10 % IGEPAL Bioshop NON999.500
용해 용액
트리스 산도 7.5 Bioshop TRS001.5
LiCl 시그마 L9650 & NBSP;
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 8.0 시그마 E5134
뚜껑 Bioshop LDS701.10
DTT Invitrogen P2325
SDS의 용해 완충액
TE 산도 7.5

Bioshop (트리스)

시그마 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))

TRS001.5

E5134

10% SDS Bioshop SDS001.500
Bisulfite 전환
수산화 나트륨 시그마 S8045
나트륨 Hydrogensulfite (나트륨 Bisulfite) 시그마 243,973 ;
히드로퀴논 시그마 H9003
낮은 녹는 점 (LMP) 아가로 오스 시그마 A9414
미네랄 오일 시그마 M8410
M2 중간 시그마 M7167
GIBCO 증류수 물을 Invitrogen 15230-196
Autoclaved 이중 증류 (DD) 물
PCR
Illustra 핫 스타트 믹스 RTG GE 헬스케어 28-9006-54
240 NG / ML 효모 tRNA Invitrogen 15401-011
5 배 그린 GoTaq 반응 버퍼 프로메가 M7911
내부 및 외부 중첩된 primers 시그마
내고
Promega pGEM-T 쉬운 벡터 피셔 과학 A1360
TA 복제
유능한 E.coli 세포 Zymo 리서치 주식 회사 T3009
장비
현미경 해부
70 ° C와 90 ° C 열 블록
37 ° C와 50 ° C Waterbaths (42 ° C에서 변환을위한)
흔들리는 것
PCR 기계

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
  2. Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic bio....

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