방법 논문

세포 생존에 박테리아와 그 영향의 동결 건조 공법

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DOI:

10.3791/4058

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2013년 8월 3일

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Uppsala Biocenter, Swedish University of Agricultural Sciences, 2Department of Engineering Sciences, Uppsala University

이 논문에서

요약

동결 건조는 종종 실행 가능한 세균 세포의 건조 제품을 얻을 수있는 쉽고 편리한 방법입니다. 프로세스의 문제는 세포의 생존이다. 여기에 우리가 세부 동결 건조하는 동안 세포의 생존을 사용 제형의 특성에 의해 영향을하는 방법을 조사하는 절차입니다.

초록

휴대 물을 가역적으로 저장을 촉진하기 위하여 미생물을 불 활성화 제거 할 수 있습니다. 제거 하나의 방법은 부드러운 탈수 방법으로 간주됩니다 동결 건조입니다. 건조하는 동안 세포의 생존을 촉진, 세포는 종종 미리 공식화된다. 제제는 세포를 내장하고 동결 건조하는 동안 세포에 부과되는 각종 유해한 스트레스에서 그들을 보호하는 매트릭스를 형성한다. 우리는 여기에서 동결 건조 후 세포의 생존율을 평가하는 일반적인 방법을 제시하고 우리는 네 가지 공식으로 얻은 결과를 비교하여 보여줍니다 이당류 자당, 폴리머 Ficoll PM400 파생 된 자당, 그리고 각각의 다당류 히드 록시 에틸 셀룰로오스 (HEC 박테리아의 두 가지 변종, P.) 및 히드 록시 프로필 메틸 셀룰로오스 (HPMC) 의 putida KT2440 및 A. chlorophenolicus A6. 이 작품에서 우리는 동결 건조 공법을 준비하는 방법과 mechan를 조사하는 방법을 보여줍니다시차 주사 열량계 (DSC), 표면 장력 측정, X-선 분석과 전자 현미경의 사용과 생존율에 해당 데이터를 관련 제제의 특성에 의해 재수 후 세포 생존의 ISMS. 고분자는 다양한 각도로 각각의 다당류 닮은 자당의 단량체 구조를 얻기 위해 선택되었다. 이 방법 설정을 사용하여 우리는 제제의 특정 물성 1 제어하는 경우 고분자 이당류로 효과적으로 세포의 생존을 지원할 수있는 것으로 나타났다.

프로토콜

1. P.의 재배 및 수확 의 putida

  1. P.의 식민지에 트립신 간장 국물 100 ㎖ (TSB)를 접종하여 모나스의 putida의 스타터 문화를 준비 의 putida 세포는 트립신 간장 국물 (TSA)로 보충 한천에서 배양. 130 rpm으로 설정 떨고 보드에 30 ° C에서 문화를 유지합니다.
  2. 7 시간 신선한 TSB-매체에 스타터 문화 동등한에서 주 문화의 최종 부피의 1 / 10로 나누어지는을 전송 한 후. 16 시간 동안 130 rpm으로 흔들어 보드에 30 ° C에서 세포를 유지합니다.
  3. 성장의 16 시간 후 세포는 실온에서 20 분 1,500 XG에서 세포 배양을 회전시켜 수확. 뜨는을 가만히 따르다 및 펠렛 성장 매체에 등장합니다 염화나트륨 용액에 세포를 다시 일시 중단하여 세포를 씻으십시오. 이 경우 150 mM의 염화나트륨 용액을 사용 하였다. , 세포는 다음 번 원심 분리하고 상층 액을 배합 매체에 세포를 현탁 전에 상층됩니다단계 3.2를 참조하십시오.

2. 다른 종의 재배

  1. 다른 박테리아 종의 프로토콜을 적응 재배 및 수확 과정은 그 종의 요구 사항에 따라 변경해야합니다. 수확 세척 단계 (들) 동안 세포를 처리 할 때 삼투 충격을 방지하기 위해, 솔루션의 삼투압 수확의 성장 매체의 일치해야합니다.

3. 세포의 수립

  1. 각각의 매트릭스 구성 요소를 계량하여 배합 솔루션을 준비하고 물에 용해. 등장 조건을 달성하기 위해, 하나 부형제의 양을 조절하거나 원하는 삼투압에 도달하기 위해 염화나트륨 또는 다른 세포와 호환 용질을 추가합니다. 같은 이당류의 낮은 분자량 물질 양을 쉽게 등장 조건을 도달하기 위하여 조정될 수있다. 고 분자량의이다 중합체와 같은 물질, tonicity 그래서 호환 셀 조정할 수있다류트, 예를 들면 염화나트륨 또는 이당류. 물질의 첨가 차례로 동결 건조 행동과 세포의 생존에 영향을 미칠 수있는 제제의 물리적 속성을 영향을 미칠 것이라고합니다.
  2. 세척 용액을 (이 경우 염화나트륨)에 가만히 따르다하고 각각의 배합 미디어 세포를 다시 일시 중지합니다.
  3. 세포가 균일하게 분산되어 있는지 확인합니다. 높은 점도의 공식을 사용하여 혼합 된 반면, 낮은 점도의 공식은, 예를 들면., 저어 줄을 추가하고 혼합 균질가 달성 될 때까지 용기를 흔들어 와류 있습니다.
  4. 동결 건조기 병에 공식 나눈다. 유리 병은 이전과 동결 건조 중에 제거 물의 양을 계산하기 위해 동결 건조 후 샘플, 빈 무게해야합니다.
  5. 병이 동결 건조기 안에 봉인 할 경우 병에 고무 마개를 추가 4.3 단계를 참조하십시오.
  6. 동결 건조 전에 각 제제의 세포를 열거, 6 단계를 참조하십시오.

    7. 4. 동결 건조

    1. 동결 건조 조건은 제제의 물리적 특성에 맞게 조정해야합니다. 가장 중요한 매개 변수는이 경우 유리 전이 온도 Tg가이 제제의, 물이 여전히 존재 나타 내기 위해 동결 농축 샘플 전이 '에 표시된다. 동결 농축 제제의 전이 '는 쉽게 시차 주사 열량계 (DSC)를 사용하여 측정 단계 7을 참조하십시오.
    2. 동결 건조 공정의 매개 변수를 조정하여 시료의 온도는 시료의 Tg를 아래로하고 항상하는 챔버 압력 즉 보조, 배합에 얼음 빠른 승화, 즉 기본 건조하고 잔류 물을 수 있습니다 건조. 샘플 온도는 건조 과정에서 '위 전이의 경우 크게 세포의 생존을 감소시킬 시료의 구조적 붕괴의 큰 위험이 있습니다.
    3. F 후 건조 제품을 보호하기 위하여reeze 건조 시료의 분위기하여 제어 할 수있다. 가능하면 진공 동결 건조 사이클의 끝에서 해제되기 전에, 동결 건조기에 샘플을 밀봉하십시오. 또는 유리 병을 선호하는 분위기로 가득 할 수 있습니다. 그것은 저장 분위기에서 모든 수분이나 산소 선물로 주변 환경에 샘플을 노출되지 않도록하는 것이 중요하는 것은 세포의 생존에 영향을 미칠 것이다.
    4. 튜브를 무게.

    5. 재수

    1. 탈 및 멸균 물 샘플을 재수. 추가 할 물의 양이 동결 건조 중에 제거하고 빈 유리 병, 동결 건조 전후 샘플 같은 유리 병의 무게로부터 계산되는 금액으로이 동일해야합니다. 소용돌이 샘플은 지금 다시 그 솔루션은 동질 나타날 때까지.

    6. 열거

    1. 각 샘플에서 100 μl를 그리는 10 배 연속 희석을합니다. 적분의 희석에서나머지 100 μL는 TSA 플레이트에 도금되어 있습니다. 플레이트는 필요한 온도와 시간에서 배양된다.

    7. 냉동 행동 제형의 특성

    1. 소량 걸린다 5 - 10 ㎎, 샘플을 뚜껑 DSC-알루미늄 냄비로 묶습니다. 참고로 빈 냄비를 준비합니다.
    2. DSC 온도 검사 프로그램을 설정합니다. 냉각이 프로그램은 동결 건조 프로그램의 동결 단계를 모방하도록 설정되어 있습니다. 냉각 반응 속도가 수화 공식의 전이 '에 영향을 미칠 수 있으므로이 수행됩니다. 난방 검사에 잘 일반적으로 조사 제제의 예상 전이 '-100 ° C. 아래의 온도를 가지고 시작하기 전에
    3. 40 ° C / 분을 사용하는 - 적절한 가열 속도, 5 일반적으로 가열 속도를 선택합니다. 기록 된 열 흐름 신호는 와트로 표현하고 가열 속도에 의해 영향을받을 것입니다. 높은 가열 속도는 전이 '의 큰 신호를 제공합니다.
    4. 온도 범위를 설정하는 그래서t는 전이 '와 제제의 녹는 양을 다룹니다.

    8. 수화 공식의 표면 장력 측정

    1. 이 실험에 사용 된 실험 장치 표면을 측정하는 뒤 Noüy 방법에 따라합니다.
    2. 주의 백금 반지 및 측정 용기를 청소합니다. 용기는 아세톤으로 세척하고 보풀이없는 티슈로 닦아하고 무색 화염 내부에서 연소된다. 반지는 무색 불꽃에 붉은 빛납니다.
    3. 솔루션과 용기를 채우고 표면을 측정하기 전에 해결하자. 평형 상태 만 오랜 시간에 도달 한 후에 솔루션의 경우, 예를 들어 고분자, 여기에 사용되는 간단한 설치 질적 데이터를 제공합니다.
    4. 높은 점도 2 % 예를 들면 솔루션 (W ​​/ W)와 공식에 대한 HEC 또는 HPMC, 표면 장력이 낮은 농도의 용액에서 측정되어야하고 추정. 이 사실을 활용하여 수행 할 수있는0.5 % 이하의 농도 (w / w)에서의 표면 장력 수준을 꺼 놓습니다.

    9. 건조 공법의 X-선 분석

    1. 매트릭스 / 박테리아의 작은 금액을 가지고 샘플 홀더에 그것을로드합니다.
    2. X-레이 회절에 샘플 홀더를 장착합니다.
    3. 샘플의 모든 결정 단계 현재를 분석 브루 커에서 EVA 프로그램 패키지를 사용할 수 있습니다.

    10. 전자 현미경

    1. 튜브의 매트릭스 / 박테리아 소량 밖으로 가지고 SEM 스텁에 고정합니다.
    2. 스퍼터 코터 (본 연구에 사용 된 열 VGScientific 폴라 SC7640) 및 AU / 팔라듐 또는 백금의 몇 m로 코트 샘플의 SEM 홀더를 넣습니다. 이 실험에서는 스퍼터링 매개 변수는 : ~ 5 1,900 V, 20mA, 20 초 - 10 nm의 오 / 팔라듐 코팅. 코팅은 영상 획득시 전기 충전을 줄일 수 있습니다. 충전이 지속되고 이미지가 발생하면 그것은 얇은 코팅으로 시작하는 것이 좋습니다되어유물, 샘플을 다시 코팅해야한다.
    3. SEM 챔버의 SEM 홀더를 넣습니다. 해당 이미지 매개 변수를 선택합니다. 그림 2 (FEI 지층 DB235)에 사용되는 악기에 우리는 5 kV의 가속 전압, spotsize 3, 5 mm와 이차 전자 검출기의 작동 거리를 사용했다.
    4. 선택적으로, 그 자세한 내용을 공개하는 고분자에 포함 된 박테리아의 단면을 잘라 집중 이온 빔을 사용할 수 있습니다.

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결과

표 1은 배합 성분에 대한 자료, 냉동 공법, 건조 시료의 구조와 배합 솔루션의 표면 장력 가열하는 동안 DSC에 의해 기록 된 열 이벤트를 표시합니다. 자당의 T g '는 -40 ° C 2, 3으로 결정되었으며, 20 % w / w 이하 자당 농도에서 감지하기 어려울 수 있습니다. -35에서 열 이벤트는 ° C 아마도 얼음 용해 2의 발병에 관련되어 있습니다. 결정 구조는 HEC와 HPMC 샘플에서 X-레이 감지도 (그림 2B 및 2C 참조) SEM에서 본 것은 염화나트륨의 일반적인 결정 양식을 중복.

그림 1A는 그람 음성 P.에 대한 생존 데이터를 보여줍니다 의 putida와 그람 양성 A. chlorophenolicus은 다른 당류 기반의 공식 공식화...

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토론

본 연구의 동기는 동결 건조하는 동안 세포의 생존을 위해 중요 할 수있는 몇 가지 제형의 특성을 조사하는 것이었다. 고유의 건조 내성이 다른 종 사이에 차이가 있지만, 그림 1A, 다른 공식 지원 세포의 생존과 유사합니다 얼마나 잘 추세에 나와 있습니다. 그것은 자당과 Ficoll의 비교로 시작하는 정보입니다. 그것은 세포의 생존을 지원하는 제제의 핵심 요소 따라서는 건조 상태에있는 세포의 단백질과 세포막의 구조를 유지, 탈수시 물을 대체 할 수있는 배합 성분 (들)의 기능이라고 생각됩니다. 같은 다당류 전분 폴리머 5,11를하지 않는 반면, 같은 자당과 같은 이당류하지만 또한이 속성을 보여 트레할로스. 고분자 이당류와 같은 방식으로 막 지질과 상호 작용하기에 너무 큰 것으로 간주됩니다. 성공적으로 동결 건조에 중요한 다른 속성미생물의 ING는 동결 건조하는 동안 (예.가 비정질 고체) 유리화하는 지원 매트릭스의 기능입니다. 비정질 구조는 분리 된 세포를 보호하...

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

작업은 DOM 프로그램과 유럽 연합 (EU) 커뮤니티 FP7 프레임 워크 프로그램의 보조금 211,684 (BACSIN)를 통해 전략적 환경 연구를위한 스웨덴 재단 (MISTRA)에 의해 지원되었다. 우리는 개념 이야기를 돕는에 대한 X-선 분석과 L. 당나라 촬영에 도움 J. Engstrand 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Ficoll PM 400GE-healthcare17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)AshlandAshland 제공
HPMC (Methocel F4M)Dow웁살라 대학교 약학부 제공
SucroseSigma-AldrichS2395
NaClSigma-Aldrich71376
Tryptic Soy brothMerck105459
Tryptic Soy AgarMerck105458
Lyostar IIFTS KineticsN.A.
Pyris Diamond DSCPerkin-ElmerN.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k DiffractometerBrukerN.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEMFEIN.A
Krüss 교육용 표면장력계KrüssN.A.

참고문헌

  1. Wessman, P., Mahlin, D., et al. Impact of matrix properties on the survival of freeze-dried bacteria. J. Sci. Food Agric. 91 (14), 2518-2528 (2011).
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