우리는 invadopodia로 인한 매트릭스 저하를 시각화를위한 형광 젤라틴으로 코팅 현미경 coverslips를 생산을위한 원형 방법을 설명합니다. 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 전산 기술이 혼합 된 인구 내에 전체 미세 필드를 포함한 다세포 그룹에 대한 하나의 세포 매트릭스 proteolysis의 결과 수준을 정량화를 위해 제공됩니다.
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방법 논문
단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정
이 논문에서
요약
초록
지역 조직에 세포 침공은 개발과 항상성에서 중요한 과정입니다. Malregulated 침공과 이후의 세포 운동은 염증, 심장 혈관 질환과 종양 세포 전이 한 등 여러 가지 병적 인 프로세스의 특징입니다. 상피 또는 내피 지하 막에서 세포 외 기질 (ECM)의 구성 요소 Focalized proteolytic 저하는 세포 침공을 시작으로 중요한 단계입니다. 종양 세포에서 체외 분석에 광범위한는 ECM 저하가 invadopodia 2,3를 칭했다 복부 고를 풍부한 막 밀어내는 구조에 의해 수행되는 결정을 내 렸습니다. 그들은 매트릭스 metalloproteinases (MMPs)의 행동을 통해 ECM 분석을 검토 ECM에 가까운 동격의 Invadopodia 양식. invadopodia을 형성하는 종양 세포의 능력은 바로 지역의 기질 및 관련 혈관 구성 요소를 3으로 침입 할 수있는 능력과 함께 연결합니다. _content는 "유리 coverslips에 코팅 염료 표시 매트릭스 단백질을 사용하여 형광 현미경에 의한 세포의 invadopodia로 인한 ECM 저하의> 시각화는 매트릭스 proteolysis 및 셀룰러 침해 가능성 4,5의 정도를 평가하기위한 가장 널리 기술로 떠오르고있다. 여기에 언급 된 상업적으로 이용 가능한 오레곤 그린 - 488 젤라틴의 공액을 활용 휘황 라벨이 표시된 유리 coverslips을 생성하기위한 표준 방법의 버전입니다.이 방법은 쉽게 빠르게 코팅 coverslips 많은 수의 생산 조정됩니다. 우리는 흔히 발생하는 일반적인 미세 유물의 일부를 보여 이 절차를 수행하는 동안 얼마나 이것들은 방지 할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 개별 셀 의해 전체 휴대폰 인구에 의해 중재 표시 젤라틴 매트릭스 저하의 정량화 할 수 있도록 즉시 사용할 수 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 표준화 된 방법을 설명합니다. 설명 절차는 정확하고 reproducibly 모니터링 할 수있는 기능을 제공 invadopodia활동, 또한 변조 단백질의 발현 또는 단일 및 다세포 설정에서 세포 외 기질 저하에 반 침해 화합물의 테스트의 효능을 평가하기위한 플랫폼으로 제공 할 수 있습니다.
프로토콜
1. 오레곤 그린 생산은 488 - 젤라틴 코팅 Coverslips
- 1.25 g 젤라틴 50 ML의 최종 볼륨에 PBS에 1.25 g의 자당을 추가하여 레이블이 지정되지 않은 5% (w / w) 주식 젤라틴 / 자당 솔루션을 준비합니다. 37 ° C에 주식 젤라틴 용액을 따뜻하게하고는 완전히 사용하기 전에 녹을 확인합니다. 4 ° C.에서 최종 혼합물을 저장
- 24 잘 플라스틱 조직 배양 플레이트의 각도에 개인 coverslip을 배치하여 13mm 직경 # 1 유리 coverslips를 청소합니다. 각도 20 % 질산 500 μl를 추가하고 30 분에 품다. 질산 솔루션을 기음과 탈 이온수로 coverslips을 세 번 씻는다.
- 실온에서 20 분 각도 50 μg / ML 폴리-L-라이신 (0.1 % 주식 솔루션에서 준비 탈 이온수에 희석) 500 μl와 코트의 coverslips. 솔루션을 기음과 PBS로 세 번 씻어. 폴리-L-라이신 코팅 놓인 라의도 코팅과 결합을 용이하게젤라틴을 beled.
- 각도에 0.5 % 글 루타 알데히드 500 μl를 (사용하기 전에 신선한 만든) 추가하고 15 분을위한 얼음에 24 잘 접시를 품다. 기음과 차가운 PBS로 세 번 씻어. 젤라틴 코팅하기 전에 PBS의 모든 흔적을 제거해야합니다....
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토론
세포 외 기질 굴욕 세포를 시각화 할 수있는 능력은 세포 침략의 초기 단계에서 사용 된 분자 메커니즘을 발견에서 도왔습니다. 1980 년대 초 4,14,15에 웬 - 티엔 첸에 의해 개척 이후 미세 분석을위한 유리 coverslips에 코팅 휘황 표시 세포 단백질은 세포 유형의 다양한 범위에 걸쳐 invadopodia 기능을 평가의 기본 기술로 떠오르고있다. 소정의 프로토콜이 일에 비슷한 기존의 형광 및 공 촛점 현미경 11,16-18에서 세포 세포 외 기질 저하의 감지에 적합 미만 2 μm 두께 collagenous 층을 형성 젤라틴 코팅 coverslips를 준비에 사용되는 기본 방법을 보여줍니다 이전에 19-21을 설명하고. 이 속성은 매트릭스 저하의 초기 발병을 감지 할 수있는 코팅 coverslips의 빠른 생산 수 있습니다. 일에 의해 부여 감도전자 전체 매트릭스 환경 (22)의 높은 고유의 강성에 대한 응답으로 invadopodia 형성.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
이 작품은 웨스트 버지니아 대학의 메리 Babb 랜돌프 암 센터에서 기금 기금에 의해 지원되었다. 우리는 초기 조언과 도움을 Susette 뮐러 (조지 타운 대학교 (Georgetown University))와 로라 켈리 감사드립니다. 웨스트 버지니아 대학 현미경 영상 시설의 사용은 (메리 Babb 랜돌프 암 센터 및 NIH 보조금 P20 RR16440, P30 RR032138와 P30 GM103488에서 지원) 굉장히 인정하고 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 / 악기의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| 젤라틴 | 시그마 | G1890 | 돼지 피부 |
| 자당 | 어부 | BP220 | |
| 12mm coverslips | 어부 | 50-121-5159 | |
| 24 잘 접시 | 어부 | 08-772-1 | BD 팔콘 |
| 질산 | Ricca | R5326000 | 20 % 솔루션 |
| 폴리-L-라이신 | 전자 현미경 과학 | 19320-B | 0.1 % 용액 |
| 글 루타 알데히드 | 시그마 | G7526 | 8 % 솔루션 |
| 오레곤 그린 488 - 복합 젤라틴 | Invitrogen | G-13186 | |
| 나트륨 borohydride | 시그마 | 213462 | |
| 트리톤 X-100 | 어부 | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| 반 cortactin (클론 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| 안티 - 플래그 항체 | Millipore | MAB3118 | |
| 알렉사 형석 647 염소 안티 - 마우스 IgG | Invitrogen | A21235 | |
| 골드 antifade을 연장 | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 공 촛점 현미경 | Zeiss | ||
| ImageJ 소프트웨어 | 공개 | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 소프트웨어 | 미디어 인공 이식 | ||
| NIS 요소 소프트웨어 | 니콘 |
참고문헌
- Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Linder,....
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