도파민은 분명히 세포 기관 및 도파민 뉴런의 dendrites을 포함 midbrain의 핵에서 규제하고 있습니다. 여기 substantia nigra (SN)과 설치류의 복부 tegmental 지역 (VTA)의 midbrain의 핵에 도파민 규정에 따라서 절개 및 샘플 처리 결과를 극대화하는 접근 방식과 결론 및 통찰력을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
도파민은 CNS에 적극적으로 공부 신경 전달 물질이다. 사실, 전위의 활동 및 보상 관련 행동의 개입은 도파민 조절과 관련된 분자 결함으로 문의 50 여년간을 육성하고있다. nigrostriatal 및 mesoaccumbens 경로의 터미널 필드 지역의 규제에 대한 분자 기초시 뇌 초점에서 도파민 규제 이러한 질문의 대부분은, striatum과 핵의 accumbens. 또한, 이러한 연구는 서부 유럽 표준시 조직 무게로 정상화와 도파민 조직 내용의 분석을 집중하고 있습니다. 같은 티로신 hydroxylase (TH) 단백질 번째 인산화, 도파민 수송 (DAT) 및 기공을 갖는 모노 아민 전송기 2 (VMAT2) 단백질로, 도파민 조절 단백질의 조사는 종종 동일한 예제에서 도파민 조직 내용의 분석에 포함되지 않습니다. 도파민 조직 내용과 그 조절 단백질 (POST-tra를 포함하여 모두를 분석할 수있는 능력nslational 수정)은 단백질 수준과 TH, DAT, 또는 VMAT2의 기능과 도파민의 관계를 해석에 내재된 능력을 제공, 또한 샘플 경제를 확장뿐만 아니라. 아직은 적은 비용,로이 번역은 수사관 '선택의 거의 모든 패러다임에서 도파민의 분자 조절에 대한 식견을 생산하고 있습니다.
우리는 midbrain에 분석을 집중. SN 및 VTA는 일반적으로 도파민 규제 대부분의 연구에서 소홀히하고 있지만, 이러한 핵 쉽게 실천으로 해부한다. 종합 도파민 조직 컨텐츠와 TH의 판독, DAT, 또는 VMAT2가 실시됩니다. 이 행위에 대한 SN 및 VTA의 도파민 기능의 영향에 문학 급성장, 그리고 그 안에 1-5 외인성 물질 또는 질병 프로세스의 impingements있다. 또한, 이러한 성장 요인과 같은 화합물은 SN 또는 VTA에서 비교적 큰 범위까지, 도파민과 도파민 조절 단백질에 지대한 영향을 미칠 우리는이 두 핵 각각의 핵 (그림 1) 특정 생체내에서 도파민 규정의 분자 메커니즘을 공개 프로필을 생산하고 해부 조직의 샘플 처리를 분리하는 해부의 기술을 설명합니다.
프로토콜
1. 해부
- 축축한 얼음 침대에서 쥐 두뇌 매트릭스 (코로나 부분은 떨어져 1mm를 차별), 5 면도칼이 들어있는 배양 접시, 그리고 # 11 메스를 진정 하라구. 별도의 용기에, 장소는 드라이 아이스에이 ML 사이즈 microfuge 튜브를 분류.
- 조사는 안락사의 방법을 선택합니다. 우리는 isoflurane, 이상적으로, 기화기를 사용하여야있는 매우 간단한 마취를하고 재현성 결과가 있습니다. 다만, 사용할 수 없습니다, 우리는 플랫폼을 포함하는 대형 배터리 항아리를 사용합니다. 승인된 환기 후드에있는 배터리 병으로 플랫폼 아래 isoflurane-포화 거즈 패드를 배치하고 isoflurane은 배터리 항아리를 포화 수 있도록 3-5분을 기다립니다. 내부 쥐를 삽입하고 바로 쥐 의식을 잃은로 잘린 위해 제거합니다. 신속하게 뇌 (이상 2 분안에) 차가운 물 속에 린스를 제거하고 냉장 쥐 두뇌 매트릭스에 즉시 배치합니다.
- 입장시 1 분에매트릭스로 뇌를 접근한 것은 striatum 및 핵의 accumbens은 midbrain의 핵 이외에 분석을 위해 필요한 경우 광학 chiasm에 주동이의 2mm 주위 시작 냉각 두뇌로 차가운 면도날을 삽입합니다. , 폰스래요 통해 중간에 도착할 때까지 각 1mm 섹션으로 차가운 면도날을 삽입 각 개별....
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토론
그림 1에 명시된 바와 같이 위에 설명된 방법은 도파민의 여러 설치 했어요 그리고 쥐 드나 마우스 중 하나에서 얻은 SN 또는 VTA 중 하나를 샘플로부터 조절 단백질의 TH, DAT, 그리고 VMAT2를 얻을 수 있습니다. 다시 말하지만,이 프로토콜을 수행의 장점은 조사가 도파민은 거의 모든 실험적인 패러다임 하에서 생체내에서 규제하고, 그동안, 어떤에서 필요한 동물의 수를 줄임으로써 상당한 실험 자료를 저장하는 방법의 작전상-일치 설치 했어요를 얻을 수 있습니다 실험.
이 조사는 얼음처럼 차가운 HPLC 버퍼의 해부 (4 ℃), 조직의 저장 용량 (최소 -70 ° C), 조직 sonication (보관 온도의 탈퇴 후 즉시 sonication)시 부과 온도 요구 사항을 관찰하고있는 절대적으로 필수적입니다 이후 펠렛 형성 및 가공. 펠렛은 sonicated 및 SDS 용액에 삶은되면 샘플 furth가 계속 발생할 수 있습니다어 실온에서 처리. 보관된 HP.......
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공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
이 작품과 같은 2,10를 인용, 자금은 노화 연구, 에드워드 P. 스타일즈 신탁 기금 및 노스 웨스트 루이지애나의 바이오 메디컬 연구 재단에 대한 미국 연방에서 MF 살바토레에 대한 연구 기금 수상에 의해, 부분적으로 제공된 그리고 아이크 Muslow Predoctoral 원정대에서 학사 Pruett까지 LSU 보건 과학 센터 - 위조.
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재료
HPLC 시스템 :
기본 시스템은 Shimadzu LC10-ADvp HPLC 펌프, 워터스시키는 717 자동 시료 주입기, 250 x 4.4 mm 5 미크론 Spherosorb ODS-1 C18 리버스 상 열 (워터스), Bioanalytical 시스템 (BAS) TL12 이중 유리로 구성되어 있습니다 탄소 전극, 두 BAS LC4B 전기 화학 감지기 및 워터스는 2 데이터 수집 및 통합 시스템의 능력을 주소서.
칼럼은 30-45에서 관리하고 있습니다 ° C (BAS LC22A 열 히터). 모바일 단계는 0.1 M의 인산 나트륨 (산도 3.0), 0.1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1-옥탄 설폰산 (이스트만 - 코닥) 0.2-0.4 밀리미터, 그리고 0.45 미크론 필터를 통해 여과 0.35 %의 acetonitrile (V / V)입니다. 유속은 1.2 ML / 분입니다. 모바일 단계의 네 리터 배치는 산도, 옥탄가 Sulfonic의 산성과 열 온도를 조정하여 분판을 위해 최적화되었습니다. 모바일 단계는 재활용하고 있으며, 지속적으로 용존산소를 제거하는 헬륨 가스를 정화한다. 모바일 위상의 재활용시간의 합리적인 기간에 좋은 해상도를 유지하는 데 거의 필수적입니다. 모바일 위상 보관 수명은 각 실행의 첫 2-7 분 시간을 낭비 돌린다 플로우 스위치 (통합에 의해 제어)를 사용하여 유지됩니다.
전극은 Ag/AgC1 기준 전극에 대하여 약 0.78와 0.95V의 가능성에 유지 관리됩니다. 높은 잠재력의 전극은 트립토판 (및 NMDA 내부 표준)의 결정에 대해 독점적으로 사용됩니다. 0.78 V의 잠재력은 트립토판 이외 monoamines과 화합물의 검출을위한 잡음 비율로 우수한 신호를 제공합니다. chromatograms는 주소서 워크 스테이션의 하드 드라이브에 저장하고, 이후 처리 및 데이터 신진 대사 금액 및 그룹 데이터를 컴파일 계산을위한 Excel 스프레드 시트로 직접 전송됩니다.
펌프 : Shimadzu LC-10AD
셀 : BAS 크로스 흐름. 유리 탄소가 0.780과 0.9에서 전극을 조사50 V의 잠재력.
감지기 : BAS LC-4B는 듀얼 채널 모드에서 운영.
데이터 Acq. 시스템 : 워터스는 프로이 능력을 주소서.
분사기 : 워터시키는 717
칼럼 : 워터스 Spherosorb ODS-1, 5 μm의 입자, 4.4 mm X 250mm.
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| 나트륨 Dodecyl 황산 (SDS) | - JT 베이커 | 4095-02 | |
| Trizma 자료 | 시그마 | T1503-1KG | |
| Trizma HCL | 시그마 | T3253-1KG | |
| 글리세린 | 시그마 | G8773-500 ML | |
| PVP-40 | 시그마 | PVP40-1KG | |
| dPBS | Gibco | 21600-069 | |
| Tween20 | 시그마 | P1379-500 ML | |
| 글리신 | 시그마 | G8898-1KG | |
| 개양귀비빛의 S | Fluka | 81,460 | |
| Bromophenol 블루 | 시그마 | B8026-5G | |
| Dithiothreitol | 시그마 | D-9163 | |
| 단백질 표준이 MG BSA | 시그마 | P5619-25VL | |
| 피어스 BCA 단백질 분석 시약 | 열 피셔 과학 | 23,223 | |
| 정밀 플러스 단백질 표준 | 바이오는 힘이에요 | 161-0373 | |
| [125I]-단백질, 특정 활동 | Perkin-엘머 |
표 2. 특정 시약.
| 시약 | 수식 |
|---|---|
| 10% SDS | 10g SDS, 100 ML DI H 2 0 |
| 1퍼센트 SDS (산도 8.2) |
|
| 구리 II 황산 솔루션 |
|
| 배 샘플 버퍼 |
|
| 1X 샘플 버퍼 | DI H 2 0을 사용하는 1X 샘플 버퍼에 3 배 샘플 버퍼를 희석 |
| 10X 버퍼를 실행하면 (4 패를 만듭니다) |
|
| 10X 전송 버퍼 : (4 패를 만듭니다) |
|
| 개양귀비빛의 |
|
| 0.2 % HCL 솔루션 | DI H 2 0 500mL에서 5.2 ML HCL |
| PVP-T20은 Soln 차단. (4 패를 만듭니다) |
|
| 10X 얼룩 버퍼 (4 패를 만듭니다) |
|
티로신 hydroxylase 표준은 :이 실험실에서 사용하는 보정 TH 단백질 및 인산화 표준은 궁극적으로 닥터 존 Haycock 11 실험실에서 유래 이전에 보정 TH 표준에 대한 TH 단백질 함량과 인산화의 stoichiometries에 대해 분석했다 PC12 세포 추출물에서 파생됩니다 .
참고문헌
- Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat. Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C.
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재인쇄 및 허가
