방법 논문

야생 유충에서 Hemocytes을 추출하기위한 간단한 프로토콜

DOI:

10.3791/4173

⸱

2012년 11월 15일

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, The George Washington University

이 논문에서

요약

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곤충 hemocytes는 곤충 개발의 모든 단계에 걸쳐 면역 및 비 면역 모두 여러 중요한 기능을, 실시합니다. hemocyte 유형 및 기능의 현재 우리의 지식은 곤충 유전자 모델에 대한 연구에서 비롯됩니다. 여기, 우리는 추출 정량화과 야생 유충에서 hemocytes을 시각화하는 방법을 제시한다.

초록

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곤충 hemocytes은 (포유류의 백혈구에 해당) 곤충의 수명주기에 걸쳐 한 여러 생리적 과정에 중요한 역할을한다. Lepidoptera (나방과 나비)와 Diptera (진정한 파리)의 주문에 속하는 곤충의 애벌레의 단계에서 hemocytes은 림프의 선 (전문 조혈 장기) 또는 배아 세포로부터 형성되어 성인 무대에를 통해 수행 할 수 있습니다. 배아 hemocytes는 염증이 기간 동안 개발과 chemotaxis 규정 동안 세포 이주에 참여하고 있습니다. 또한 세포 apoptosis에 참여하고 embryogenesis 2 필수적입니다. Hemocytes는 세포 확산, 세포 집합, nodules의 형성, phagocytosis 및 외국 침략자 3의 캡슐화와 같은 여러 기능을 포함하는 곤충 본래 면역 반응의 세포 팔을 중재. 그들은 같은 PR로도 감염시 특정 곤충 체액 방어에서 일을 꾸미고 책임이 있습니다항균 펩티드 및 기타 이펙터 분자 4, 5 oduction. Hemocyte 형태 및 기능은 주로 과일 파리, Drosophila melanogaster 6, 7, 모기 Aedes aegypti 및 아노펠레스 gambiae 8, 9, 담배 hornworm, Manduca sexta 10, 11을 포함, 유전자 또는 생리 곤충 모델에서 공부하고 있습니다. 그러나, 작은 정보는 현재 다양성, 분류, 형태, 특히 비 모델 곤충 종, 야생 12 일부터 수집 된 사람들의 hemocytes의 기능에 대해 존재합니다.

여기 야생 유충에서 hemocytes를 추출하기위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 설명합니다. 우리는 어미에서 두 번째의 음절 instar Lithacodes fasciola (노란색 어깨 슬러그 나방) (그림 1)과 Euclea delphinii (가시 오크 총알) 유충을 (Lepidoptera : Limacodidae)를 사용하여 보여주고 hemolymph의 충분한 볼륨 (곤충 혈액)격리 및 hemocyte 번호는 개인 애벌레에서 계산 할 수 있습니다. 이 방법은 효율적으로 이러한 종뿐만 아니라 현장에서 수확 기타 관련 lepidopteran의 유충에 hemocyte 유형을 공부하는 데 사용할 수 있습니다, 또는 그것은 쉽게 미생물 또는 기생 생물 13 감염에 따라 hemocyte 기능을 조사하기위한 면역 assays과 함께 사용할 수 있습니다.

프로토콜

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1. 재료 준비

  1. 붕규산 유리 모세관 튜브 및 micropipette의 풀러를 사용하여 바늘 (1-2 μm 팁과 3~4mm 테이퍼)를 준비합니다. 악기 설정 : 램프 : 561, 속도 : 20, 열 : 560, 지연 : 1, 풀다운 : 100, 압력 : 500.
  2. 태아 소 혈청 (FBS)의 10 % 항응고제 버퍼의 20 % (98 MM NaOH, 186 MM NaCI, 1.7 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 41 MM 구연산, pH를 4.5로 보충 그레이스의 중간 (GM)의 60 %를 수집 솔루션을 준비 ). 위의 솔루션은 무균 조건 하에서 신선 준비 항상 얼음에 보관됩니다.
  3. GM의 90 %가 FBS의 10 %를 보충 : 부화 버퍼 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션은 또한 신선한 준비 항상 얼음에 보관됩니다.
  4. 적어도 15 μl의 총 × 수집 및 부화 솔루션 모두에 대한 곤충의 수를 준비합니다.

2. 수집 솔루션과 유충의 주입

  1. 어미에서 두 번째의 음절 기능을 마취hemocyte 추출하기 전에 20 분을 위해 얼음을 냉각하여 타르 애벌레.
  2. 20 ML 유리 주사기 (그림 2)에 연결되어있는 튜브에 깨끗한 모세관 바늘 (16 게이지)의 뭉툭한 끝을 맞 춥니 다. 수집 솔루션은 실험실 벤치에 열고 천천히 버퍼로 모세관을 채울가 포함 된 튜브를 둡니다. 모세는 보통 무한 궤도의 크기에 따라 수집 솔루션의 약 10-15 μl로 가득 차 있습니다 (애벌레 총 신체 질량의 10 밀리그램 당 약 1 μl 솔루션 = 총 신체 질량의 0.01 %). 해부 현미경 옆에 배치됩니다 점토의 공에 바늘을 놓습니다.
  3. 배양 접시에있는 애벌레를 놓습니다. 곤충은 spiracles는 (그림 3) 명확하게 볼 수 있습니다 있도록 자사의 측면에 위치해야합니다.
  4. 해부 현미경으로 볼 수 있지만, 포셉 한 쌍의 곳에서 애벌레를 개최하고 spiracles 중 하나에 바늘 가까이있는 곳에서종파의 표피는 일반적으로 부드러운이다. 부드럽게 곤충의 몸에 대해 모세관 바늘을 누르십시오. 바늘이 표피를 관통되면, 무한 궤도 (그림 3)에 솔루션의 전체 볼륨을 주입. 이 애벌레에 공기 거품을 주입하지 않도록하는 것이 중요합니다. 애벌레의 몸은 주사에 따라 (예를 들어, 20 % 볼륨 증가) 팽창 할 것입니다하지만, 파열 또는 진흙 없습니다.
  5. 상처 (그림 3)에서 누출에서 버퍼를 방지하기 위해 dorsally 곤충을 위치, 얼음에 애벌레를 반환합니다.
  6. 반복 hemolymph 추출에 사용되는 각각의 애벌레에 대해 2.1-2.4 단계를 반복합니다. 이 단계에서, 모든 곤충은 계속하기 전에 30 분을 위해 얼음에 진정 할 수 있습니다.

3. Hemocytes의 추출

  1. 해부 현미경으로 배양 접시에있는 애벌레를 놓습니다.
  2. 멸균 scalpe를 사용하여 애벌레의 뒤쪽 지역의 얕은 (2-3mm 길이) 절개를합니다 리터 (그림 3). 목표는주의 깊게 찔린 큐티클을하는 것입니다 및 개인 곤충의 hemocytes을 포함하는 버퍼 / hemolymph 믹스를 수집하고, 내장 또는 기타 내부 장기를 손상 않도록주의보십시오.
  3. 10 μl 피펫 팁으로 hemolymph 믹스 (약 10-20 μl)를 수집하면서 다시 내부 조직 (그림 3)을 손상하지 돌보는, 유연한 플라스틱 집게를 사용하여 부드럽게 애벌레를 당겨 요. Hemolymph은 애벌레의 몸에서 짜낸 비말에서 수집됩니다. 애벌레의 유골을 폐기하십시오.
  4. 별도의 표시 siliconized 0.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 각각의 애벌레에서 hemolymph를 수집합니다.
  5. 개인 애벌레에서 수집 한 각 hemolymph 샘플에 부화 솔루션의 동일한 볼륨 (약 10-20 μl)를 추가합니다. 항상 얼음에 hemolymph 샘플을 보관.
  6. 반복 실험에 사용 된 각 애벌레에 대해 3.1-3.5 단계를 반복합니다.
Hemocytes의 르 "> 4. 정량화

  1. hemolymph 샘플을 혼합 사전에 계산 hemocytes에 바로 부화 솔루션입니다. 이 치료 hemocytes의 적절한 분리를 허용하고 거리며 걷게 방지 할 수 있습니다.
  2. hemocytometer로 부화 솔루션과 혼합 hemolymph 샘플의 10 μl를 전송하는 깨끗한 피펫 팁을 사용합니다.
  3. 복합 현미경 사용 세고 큰 사각형의 적어도 15 (사각형 하나의 영역 0.1 mm : 0.04 mm 2, 깊이)에 hemocytes의 수를 기록 hemocytometer의 중심 그리드 (그림 3). 15 사각형의 hemocytes의 수의 총 합계를 구하려면이 값을 추가합니다.
  4. 철저하게 증류수와 탈 이온수로 세척 병을 사용하여 hemocytometer 및 커버 슬라이드를 씻어 각 샘플 사이의 Kimwipes (킴벌리 - 클락)와 건조 닦으십시오.
  5. 반복은 각 hemolymph 샘플 4.1-4.4 단계를 반복합니다.
  6. hemolymph volum의 ML 당 hemocytes의 평균 수를 계산각 모충을위한 e는로는 다음과 같습니다

hemocytometer 그리드의 각 광장의 총 부피 (0.04 mm 2 영역) × (0.1 mm 깊이) = 0.004 mm 3 × 15 사각형 = 0.06 mm 3 모든 15 계산 사각형의 = 총 볼륨입니다.

(모든 15 계산 사각형의 / 전체 볼륨 계산 15 사각형의 hemocytes의 총 개수의 합) × 2 희석 계수 = hemocytes / mm 3의 수 x 1,000 = hemocytes / hemolymph의 ML의 수.

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결과

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여기에 설명 된 프로토콜은 각각의 유충에서 곤충 hemolymph의 10-20 μl의 최소 볼륨의 수집 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 수집 Hemocytes은 셀 거리며 걷게, melanization 결함, 조직 파편이나 기타 오염 물질 무료입니다. 따라서 hemocytes은 쉽게 관찰하고 현미경으로 계산하고, 여러 곤충은 몇 hosur에서 관찰 할 수있다 할 수 있습니다. 우리는 우리의 샘플에서 hemocytes의 대부분이 plasmatocytes 3 ​​(hemocytes이 비대칭 확산) (그림 4)로 구성되어 있다고 관찰했다. 현재 세부 (Stoepler 외., 게시되지 않은 데이터)에서 이러한 유충에있는 다른 hemocyte 유형을 특성화하고 있습니다. 여기에 설명 된 방법은 현장 실험에서 수집 한 개인 유충에 대한 총 hemocyte 숫자를 계산을위한 신속하고 정확한 방법을 제공합니다.

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토론

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의학적으로 중요한 곤충 lepidopteran 모델 곤충에서 hemocytes를 추출하기위한 방법은 이전 9, 14보고되었습니다. Hemocyte 추출 방법은 곤충 종에 따라 조정되며, 곤충 및 형태학의 기능의 발달 단계. 예를 들어, Manduca의 애벌레에서 hemolymph 절연은 쉽게 복부 15의 끝 부분 곡선 경적을 snipping 의해 수행 할 수 있습니다. 슬러그 유충 (Limacodidae)이 복부 구조를 부족하기 때문에, 우리는 소규모 현장 수집 유충에서 hemolymph 추출을위한 별개의 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 더 실험에 저장하거나 처리 할 수​​ hemocyte 세포의 큰 숫자를 포함하는 충분한 hemolymph 볼륨을 분리에 대한 효율적인 증명한다. 또한, 성인 모기의 hemocyte 컬렉션은주의 다리의 제거, 날개와 복부 16 팁을 포함 시간이 많이 소요 단계를 포함 . 비슷한 단계의 프로토콜에 필요하...

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공개 사항

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

감사의 글

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TMS는 본 연구 기간 동안 할란 신뢰 휄로 십 (GWU)에서 지원되었습니다. 필드 컬렉션에 대한 자금 및 L.를 양성 fasciola와 E. delphinii는 JTL에 NSF 부여 DEB 0,642,438에 의해 제공되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트
Micropipette 풀러 셔터 악기 P-1000
붕규산 유리 관 셔터 악기 B100-50-10 OD : 1.0, ID : 0.50 mm
그레이스의 중간 시그마 G8142
태아 소 혈청 온도 피셔 과학 SH3007102 inactivated 열
뒤몽 # 5 포셉 정밀 과학 도구 11252-40
Neubauer hemocytometer Hausser 과학 3200
플라스틱 tubiNG 트라이 테크 TT-3-32OD OD : 3 / 32 인치, ID : 1 / 32 '
유리 의료 주사기 포르투나 Optima D-97877 50 ML 볼륨
무딘 끝 바늘 소형 부품 NE-162PL-25 16 게이지 X 1 "길이

참고문헌

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