또한 부동액 단백질로 알려진 아이스 바인딩 단백질 (IBPs)는, 얼음의 성장을 억제하고 조직의 cryopreservation에서 사용할 수있는 유망 첨가제입니다. IBPs을 조사하는 데 사용되는 주요 도구는 nanoliter의 osmometer입니다. 우리는 광학 현미경에 장착 홈 디자인 냉각 단계를 개발하고 맞춤형 LabVIEW 루틴을 사용하여 제어. nanoliter의 osmometer는 매우 민감한 방식으로 샘플 온도를 조작 여기에 설명했다.
이 논문에서
요약
초록
부동 단백질(antifreeze proteins), 얼음 구조화 단백질(ice structuring proteins), 열 이력 단백질(thermal hysteresis proteins) 및 얼음 재결정 억제 단백질(ice recrystallization inhibition proteins)을 포함하는 얼음 결합 단백질(IBPs)은 저온 적응 생물에서 발견되며, 얼음 결정과 상호작용함으로써 생물을 동결 손상으로부터 보호합니다. IBP는 어류1, 식물2, 3, 절지동물4, 5, 균류6 및 박테리아7를 포함한 다양한 생물에서 발견됩니다. IBP는 얼음 결정 표면에 흡착되어 IBP 흡착 부위에서 물 분자가 얼음 격자에 결합하는 것을 방지합니다. 흡착된 IBP 사이의 결정 표면에서 성장하는 얼음은 높은 곡률을 형성하며, 이는 얼음 결정이 성장하는 온도를 낮추는데, 이러한 현상을 깁스-톰슨 효과(Gibbs-Thomson effect)라고 합니다. 이러한 강하는 융점과 비평형 응고점 사이에 간격(열 이력, TH)을 생성하며, 이 범위 내에서 얼음 성장이 중단됩니다8-10, 그림 1 참조. IBP 연구에 사용되는 주요 도구 중 하나는 나노리터 삼투압계(nanoliter osmometer)로, 이는 IBP 용액의 TH 활성 측정을 용이하게 합니다. Clifton 기기(Clifton Technical Physics, Hartford, NY) 및 Otago 기기(Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand)와 같은 나노리터 삼투압계는 나노리터 부피 방울의 융점 강하를 측정하여 용액의 삼투압을 측정하도록 설계되었습니다. 이러한 장치들은 눈물11과 같은 생물학적 샘플의 삼투압을 측정하는 데 사용되었으며, IBP 연구에서도 유용함이 입증되었습니다. 그러나 이러한 나노리터 삼투압계의 수동 제어 방식은 실험적 가능성을 제한했습니다. 온도 변화율을 안정적으로 제어할 수 없었으며, Clifton 기기의 온도 범위는 4,000 mOsmol(약 -7.5 °C)로 제한되었고, 시간에 따른 온도 기록 기능을 사용할 수 없었습니다.
본 연구진은 LabVIEW 플랫폼(National Instruments)을 사용하여 컴퓨터 제어식 맞춤형 나노리터 삼투압 측정 시스템을 설계했습니다. 이전에 설명된9, 10 콜드 스테이지는 물이 순환하는 금속 블록을 포함하고 있어 방열판 역할을 하며, 이는 그림 2에 나와 있습니다. 이 블록에는 LabVIEW 모듈을 통해 제어 가능한 상용 온도 컨트롤러로 구동되는 열전 냉각기가 부착되어 있습니다(그림 3 참조). 자세한 내용은 아래에 제공됩니다. 이 시스템의 주요 장점은 정밀한 온도 제어가 가능하다는 점입니다(그림 4 참조). 자동 온도 제어를 통해 고정된 온도 램프와 추가적인 실험 세부 정보가 포함된 비디오 현미경 출력을 동기화할 수 있습니다.
TH 활성의 시간 의존성을 연구하기 위해, 남극 박테리아 Marinomonas primoryensis (MpIBP) 유래의 58 kDa 고활성 IBP를 테스트하였습니다12. 이 단백질은 Peter Davies 그룹(Queens University)에서 개발한 컨스트럭트를 통해 강화 녹색 형광 단백질(eGFP)이 태깅되었습니다10. 우리는 온도 변화 프로파일이 TH 활성에 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 이러한 실험에서 온도 프로파일을 정밀하게 제어함으로써 TH 측정 결과가 크게 개선되었습니다. 또한 나노리터 삼투압계를 사용하여 IBP의 재결정 억제 능력을 테스트하였습니다5, 13. 일반적으로 재결정은 작은 결정이 소모되면서 큰 결정이 더 크게 성장하는 현상입니다. IBP는 낮은 농도에서도 재결정을 효율적으로 억제합니다14, 15. 우리는 LabVIEW로 제어되는 삼투압계를 사용하여 얼음의 재결정을 정량적으로 추적하였으며, 이미지의 실시간 비디오 분석과 시료 챔버의 온도 피드백을 동시에 이용하여 일정한 얼음 분율을 유지하도록 하였습니다13. 실시간 계산을 통해 실험 과정 중에 추가적인 제어 옵션을 제공할 수 있습니다. 온도 제어 마이크로유체 장치를 수용하기 위한 도립 현미경용 스테이지가 개발되었으며, 이에 대해서는 다른 문헌에서 기술될 예정입니다16.
저온 스테이지 시스템
냉각 스테이지 어셈블리(그림 2)는 구리판을 냉각시키는 일련의 열전 냉각기로 구성됩니다. 열전 냉각기 아래의 밀폐된 구획을 통해 냉수를 흘려보내 스테이지에서 열을 제거합니다. 구리판 중앙의 직경 4 mm 구멍은 관찰창 역할을 합니다. 서미스터를 장착하기 위해 직경 1 mm의 인플레인(in-plane) 구멍을 뚫었습니다. 여러 개의 구멍(직경 500 μm)이 있는 맞춤 제작된 구리 디스크(직경 7 mm)를 구리판 위에 놓고 관찰창과 정렬시켰습니다. 공기를 35 ml/sec의 유량으로 펌핑하고 Drierite(W.A. Hammond)를 사용하여 건조시켰습니다. 건조 공기는 냉각 스테이지에서 건조한 환경을 유지하기 위해 사용되었습니다. 스테이지는 9핀 연결 단자를 통해 온도 컨트롤러(모델 3040 또는 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US)에 연결되었습니다. 온도 컨트롤러는 케이블을 통해 컴퓨터의 GPIB-PCI 카드(National instruments, Austin, Texas, USA)에 연결되었습니다.
프로토콜
0. 예비 절차
- 유리는 솔루션 주입을위한 모세관. 모세 풀러을 (Narishige, 도쿄, 일본)를 사용, 유리 모세관 마이크로 튜브 (브랜드 GMBH, Wertheim, 독일)에서 좋은 시작과 함께 날카로운 피펫을 준비합니다. 개방의 크기는 깨끗한 물에서 고급 버블 링을 얻기 위해 모세관을 통해 공기를 전달하여 확인해야합니다. 모세가 닫혀 있다면, 하나는 가장자리를 위반하여 열 수 있습니다. 이것은 튜브 벽을 포함하는 물에 대해 누르거나 부드럽게를 긁적에 의해 수행 될 수있다. 개방 거의 차단되어 있지만 충분히 하위 mm 거품의 형성을 허용하도록 열어되어있는 모세관 등을 준비합니다.
- 구리 디스크 청소. 더블 증류수로 씻어 후, 0.1 % 마이크로-90 비누 (콜 - Parmer, 버논 힐스, 일리노이, 미국)의 10 분의 구리 디스크를 Sonicate. 이소프로판올 (기술) 솔루션으로 디스크를 소개하고 10 분에 다시 sonicate. 지느러미동맹국, 필터링 공기를 사용하여 디스크를 건조. 이 청소 단계는 실험 사이의 IBP 오염을 방지하는 것이 중요합니다.
- 더블 레이어 coverglass 조립. coverglass 조립은 커버 유리 표면에 수분을 응축하지 않고 샘플 관찰을 할 수 있도록 준비되었습니다. 이것은 다음 뜨거운 아교 총 접착 두개가 coverslips 사이 Drierite (WA 해먼드 Drierite, 크세 니아, 오하이오, 미국) 입자 (직경 2mm)를 배치에 의해 달성되었다. 이 구성 예제는 낮은 온도로 냉각하고 관찰 창에 건조 공기를 날려 할 필요가 제거되었을 때 시야를 가리지 수 결로하지 못했습니다.
1. 냉각 단계 설정
- 4mm 내경 Tygon 튜브 (생 Gobain, 파리, 프랑스)로 냉각 단계의 물 흐름 입구와 출구를 연결하고, 워터 펌프로 물 흐름 입구 관을 연결합니다.
- 냉각 단계 t의 입구에 4mm 내경 Tygon 튜브를 연결건조한 공기를 제공 O. 공기가 인라인 Drierite 열을 사용하여 건조되었습니다.
- 공기와 물 펌프를 운영하고 있습니다. 냉각 요소가 히트 싱크없이 실행하지 말아야합니다.
- 온도 컨트롤러, 카메라, LabVIEW 루틴을 사용합니다.
2. 샘플 준비
- 디스크를 통해 교련 500 μm 구멍을 갖는 7mm 직경의 구리 디스크의 뒷면에 집중 기름 B (Cargille 실험실, 삼나무 로브, 뉴저지, 미국)의 3-4 μl 소적를 놓습니다.
- 아래로 향한 집중 오일 측과 냉각 무대에서 구리 디스크를 배치합니다.
- 2 ML 유리 주사기 (Poulten-그라프, Wertheim, 독일)의 다른 쪽 끝에서 연결 0.7 mm 내경 Tygon 튜브에 모세관 튜브를 (무딘 가장자리)에 연결합니다.
- 이전 모세관 튜브를 사용하기 시작합니다 (예비 절차를 참조) 적절한 크기인지 확인하기 위해 모세관의 작은 구멍을 확인합니다.
- 천천히 gla를 삽입SS은 준비된 IBP 단백질 샘플 튜브 (산도 8시 20 밀리미터에서 2.4 μM MP IBP-GFP CaCl 2, 25 MM 트리스 - HCL, 준비 대한 자세한 내용은 참조 10 참조)으로 모세관과 모세관 유리가 0.1이 포함되어 때까지 유리 주사기를 당겨 단백질 솔루션 μl.
- LabVIEW 소프트웨어를 통해 비디오 녹화를 시작합니다.
- 냉각 무대에서 구리 디스크에있는 구멍 중 하나에 모세관 유리 (단백질 솔루션을 포함)의 날카로운 가장자리를 삽입합니다.
- (올림푸스, 도쿄, 일본, 10X 목적) 현미경으로 관찰하는 동안주의 깊게 유리 모세관 팁과 집중 기름 층을 관통하고, 단백질의 소량 (~ 10 NL)를 제공하기 위해 유리 주사기를 (아주 섬세) 키를 눌러 200 μm의 비말을 만드는 솔루션입니다.
- 더블 레이어 coverglass 조립체 (예비 절차 참조) 냉각 단계에서 구멍을 다룹니다.
3. TH 활동 측정
- 사전ss가 냉각 버튼을 -40로 온도를 설정 ° C.
- 처음에는 솔루션 비말가 명확하게됩니다. 낮은 온도에서 일반적으로 범위 -30 ° C -35에 대한 해결책이 고정되었음을 나타내는 ° C, 비말의 색상이 변경됩니다. 대량 얼음이 녹기 시작할 때까지 샘플 얼려 후 즉시 천천히 온도를 높일 수 있습니다. 온도의 점진적인 증가는 샘플의 전체 녹는 될 수있는 온도의 오버 슈팅을 방지 할 필요가 있습니다.
- 50x 목표로 전환하여 온도를 조절하여 얼음을 녹기 시작합니다. 이 조정은 대화 형이며, 마지막 단계는 일반적으로 0.002 ° C.의 작은 온도 단계를 사용하여 수행됩니다 하나의 크리스탈이 남아 때까지 녹기를 계속합니다. 크리스탈의 마지막 크기는 10 μm 주변에 있어야합니다. 용해가 중단 한되는 최고 온도는 융점로 결정되며 나중에 비디오 분석 단계에서 정확하게 결정됩니다. <리> 크리스탈의 녹는 점 아래 섭씨 학위를 몇 hundredths로 온도를 설정하고 10 분 지연 온도 램프를 시작합니다. 원하는대로 ramping 속도를 조정합니다. 이 기간 동안 크리스탈은 IBPs에 노출 될 것입니다.
- 10 분 노출 시간이 완료되면, 온도는 LabVIEW 루틴의 제어하에 자동으로 줄어 듭니다.
- 온도 감소로 결정 모양을 관찰합니다. 어떤 시점에서, 얼음 크리스탈의 갑작스러운 폭발이 관찰 될 수 있습니다. 이 문제가 발생되는 온도는 크리스탈 버스트 온도로 기록됩니다.
- 정확한 녹는 점과 버스트 온도를 결정하기 위해 비디오 분석을 사용합니다. 첫째, 비디오 분석을 사용하여, 정확한 녹는 점을 찾으십시오. 용해가 중단 한되는 최고 온도가 녹는 점으로 결정됩니다 연상케합니다. 스프레드 시트 프로그램에서이 녹는 점을 문서화. 그런 다음 정확한 크리스탈 버스트 온도를 결정하고,이 값을 문서화뿐만 아니라. 녹는 점과 어는점, 또는 크리스탈 버스트 온도, 사이의 차이점은 IBP 솔루션의 열 이력의 활동입니다.
4. 시간에 따라 달라 TH 활동의 측정
- 얼음의 단일 크리스탈을 준비하는 제 3.1-3.3에 설명 된 프로토콜을 따르십시오.
- 크리스탈 형성 한 후, 원하는대로 진입로를의 지연 시간을 설정하고, 램프를 켜십시오.
- 온도가 자동으로 한 번 램프 지연 시간이 경과 (사업자의 요구에 따라) 고정 비율로 감소합니다.
- 크리스탈 버스트가 발생되는 온도를 문서화. 노출 시간 (크리스탈 형성과 크리스탈 버스트 사이의 시간) 계산합니다.
- 다양한 지연 시간에 대한 실험을 반복하고 TH 활동의 시간 의존도를 평가하는 노출 시간의 함수로 TH 활동을 하겠나.
결과
TH 시간 의존성 측정
LabVIEW 운영하는 nanoliter의 osmometer 정확한 TH 활동 측정의 성능을 용이하게한다. 일정한 온도 감소 속도는 TH 시간 의존성의 측정을 사용할 수 있습니다. nanoliter의 osmometer으로 활성화 정확한 온도 제어는 이러한 실험에 대한 중요한했습니다. 솔루션에 IBPs에 얼음 결정의 노출 시간은 크리스탈 (크리스탈 버스트) 주변 얼음의 갑작스런 성장 때까지 크리스탈의 형성에서 기간 (녹는 과정의 끝)로 정의됩니다. 우리는 IBPs에 얼음 결정의 노출 시간이 결정적인 TH 활동에 영향을 것으로 나타났습니다. IBP 노출 (몇 초)의 짧은 기간은 MP IBP-GFP 솔루션 (2.4 μM) (그림 5)에서 낮은 TH 활동을 생산. 그 4 분 IBP 노출의 고원에 도달 할 때까지 TH 활동은 IBP 노출 시간 증가했다. 높은 IBP 농도에서, 판AU는 짧은 시간에 도달했습니다.
그림 1. 도식 다이어그램 도시 IBPs은 얼음으로 adsorbed. 10 일부터 허가를 채택했다.
그림 2. 냉각 무대. A) 현미경에 튜브로 연결되어 있습니다. B) 위의 리드없이. C) 도식 다이어그램.
그림 3. LabVIEW 인터페이스의 스크린 샷. 망할 CIA큰 그림을 보려면 여기를 ick.
그림 4. 온도 안정성 그래프. 온도 컨트롤러는 온도 0.01 ° C 매 15 초를 내려하도록 설정되었습니다.
그림 5. IBPs에 얼음 크리스탈 노출 시간의 함수로 MP IBP의 TH 활동. 때마다 포인트 3-6 실험의 평균입니다.
토론
이 작품은 특별한 온도 제어 TH 활동의 정확한 측정을 가능하게하는 컴퓨터 제어 nanoliter의 osmometer의 작동을 보여줍니다. 어떤 온도에 민감한 시스템에서 원치 않는 온도 기울기는 피해야합니다. 여기에 제시된 장치에서 온도 기울기를 방지하려면 테스트 솔루션 물방울이 구리 디스크 냉각 단계 (단계 2.7)의 구멍의 중심에 위치해야합니다. 또한, 단일 크리스탈은 비말의 중심에보다는 가장자리 근처에 있어야합니다 (대부분의 경우에이 저절로 발생합니다.) 설명 시간 의존성은 냉각 속도가 TH의 판독에 영향을 미칠 수 있음을 나타냅니다. 따라서, 우리는 결정을 냉각하기 전에 솔루션에 노출 된 기간 동안 시간에 대한 보고서뿐만 아니라, 냉각 속도 등의하시기 바랍니다. 우리는 일반적으로 0.01에서 온도를 내려 ramping하기 전에 10 분을 기다렸 ° C 각 4 초 단계를 반복합니다.
LabVIEW 제어 공동oling 단계는 마이크로 유체 장치는 열 조작 할 수있는 역 현미경으로 사용하기 위해 적응되었다. 이 시스템은 eGFP 9, 10, 16로 태그가 얼음 결정과 IBPs를 포함하는 솔루션 교환 실험의 성능을 용이하게한다. LabVIEW 제어 시스템은 지정된 적응 전기 회로를 통해 3040 온도 컨트롤러를 연결하여 클리프톤 단계에 적용 할 수 있습니다. 이러한 시스템은 데이비스 연구소 17에 운영하고 있습니다. LabVIEW 소프트웨어와 클리프 튼 단계에 대한 지정 적응 전기 회로 설계는 요청시 이용 가능합니다.
결론적으로, 우리는 중요한 제어 및 조작 온도 및 실시간 분석을위한 LabVIEW 루틴을 통해 비디오 인터페이스를 조정 온도 증가와 감소의 속도 (0.002 ° C 감도 포함), 촉진 nanoliter의 osmometer을 설명합니다. 이 시스템은 importan 아르 재현 속도 제어 실험을 수행 할 수 있습니다얼음과 IBP 상호 작용의 동역학을 조사에 대한 t. 이러한 실험 IBPs의 행동의 메커니즘을 둘러싼 여러 장기 논쟁 문제를 해결 할 수 있습니다.
공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
이 연구는 ISF, NSF, 그리고 ERC에 의해 지원되었다. 우리는 랜디 밀포드, 마이클 코렌, 덕 Shafer, 그리고 제레미 데니슨의 온도 단계에 대한 기술적 인 도움을 인정하고 싶습니다. 소프트웨어 개발 지원은 또는 첸, 디 슈, Rajesh Sannareddy, 그리고 Sumit Bhattachary에 의해 제공되었다. 우리는 MP IBP의 단백질과 도움이 토론을 보려면 공동 교수 피터 L. 데이비스 박사 로리 A. 그라함 감사드립니다. 우리는 또한 감사 실험실 구성원 박사 마야 바 - Dolev, Yangzhong 진 박사 Yeliz Celik, 닥터 나탈리아 Pertaya, Ortal Mizrahy, 그들의 사용자 의견 Shlomit 사람.주세요
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 / 모델 | 코멘트 |
| 집중 오일 타입 B | Cargille 연구소 | 16,484 | |
| Drierite | WA 해먼드 Drierite | 043,063 2,270g | |
| 마이크로 90 청소 솔루션 | 콜 - Parmer | EW-18100-11 | |
| 풀러을 모세관 | Narishige | PB-7 | |
| 유리 모세관 튜브 | 브랜드 GNBH | 7493 21 | 길이 75mm, 직경 1.15 |
| 온도제어 장치 | 뉴 포트, 어빈, 캘리포니아, 미국 | 모델 3040 | 모델 3040 |
| 빛 현미경 | 하늘 | 모델 BH2 | |
| 10X 목표 | 하늘 | S 계획 10, 0.3, 160/0.17 | |
| 50x 목적 | 니콘 | CF 계획, 50X/0.55 에피 ELWD | |
| CCD 카메라 | Provideo | CVC-140 | |
| Tygon 튜브 | 생 Gobain, 파리, 프랑스 | Tygon 제제 S-50-HL 관 | |
| 유리 주사기 (2 ML) | Poulten - 그라프, Wertheim, 독일 | 7 10,227 | |
| GPIB-PCI 카드 | 내쇼날 인스트루먼트, 오스틴, 텍사스, 미국 | 778032-01 | |
| 비디오 프레임 GRAbber IMAQ-PCI-1407 | 내쇼날 인스트루먼트, 오스틴, 텍사스, 미국 | 322156B-01 | |
| LabVIEW 시스템 디자인 소프트웨어 | 내쇼날 인스트루먼트, 오스틴, 텍사스, 미국 | 버전 8 | |
| DiVx 저자 소프트웨어 | DiVx LLC, 샌디에고, CA, USA |
참고문헌
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