의 zygotes을 정화하려면 S. cerevisiae, 반대 결합 유형의 haploid 세포는 흐름 세포 계측법 기반 프로토콜을 사용하여 빨간색 또는 녹색 형광 접합자 형성을 허용 공동 incubated 단백질, 그리고 fractionated을 표현하도록 설계되었습니다. 높은 강화 분율은 초기 자손의 후속 "omic"연구, 복구 및 접합자 morphogenesis의 체계적인 조사를 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
Zygotes는 효모 등 여러 생물의 수명주기의 haploid와 diploid 상태 사이의 중요한 중간체, (그림 1) 1. S. 아르 cerevisiae는 별개의 결합 유형 (마타, MATalpha)의 haploid 세포의 융합에서 결과를 zygotes과 연속의 놀랍도록 비대칭 mitotic 부문이의 결과로 많은 20로 diploid의 자손을 생성하는 해당 안정 diploids에 상승을 제공합니다. 접합자 형성은 사건의 복잡한 순서에 의해 조율되어 있습니다 :이 과정에서 용해 결합 요소는 세포 세포 융합에 세포주기와 절정에 달하다 중단을 촉진 수용체 - 매개 신호 폭포를 게재하고, 수용체 기원하기 위해 바인딩합니다. Zygotes는 전구 또는 줄기 세포 기능의 모델로 간주 될 수 있습니다.
대부분 zygotes의 형성에 대해 알게되었지만 및 zygotes는 일반 signif의 휴대 분자 질문을 조사하는 데 사용되었습니다 있지만,icance는 거의 모든 연구 zygotes가 3-8 haploid 세포의 과반수 인구 함유되어있는 결합 혼합물의 사용을 만들었습니다. 접합자 형성 생화학의 여러 측면과 접합자의 지속적인 삶을 따라서 uninvestigated 남아있다.
효모 zygotes의 정화의 보고서는 침강 특성 9 일 기준으로 프로토콜을 설명하지만,이 침전 기반 절차는 우리의 손에 약 90 % 순도를 얻을 수 없습니다. 또한,이 세포는 hypertonic sorbitol에 노출되는 단점이 있습니다. 따라서 우리는 다양한 정화 절차를 개발했습니다. 이러한 목적을 위해, 빨간색 또는 녹색 형광 단백질을 표현 haploid 세포의 쌍 접합자 형성, 다양한 시간에 수확하고, 결과 zygotes이 흐름 세포 계측법 기반 정렬 프로토콜을 사용하여 정제 된 수 있도록 공동 incubated했다. 이 기술은 결함과 성숙의 편리한 시각적 평가를 제공합니다. 평균 순도분수의 약 90 %이다. 수확의 타이밍에 따르면, 성숙의 학위를 변화의 zygotes은 복구 할 수 있습니다. 정화 샘플 초기 자손의 복구를 위해,이 전구 세포의 체계적 조사에 대해 "omic"연구에 대한 출발의 편리한 점을 제공합니다.
프로토콜
1. Haploid 세포의 성장
- S. 성장 표준 조건 10 세 미만 S288C 배경 (BY4741)에서 cerevisiae 세포.
- 두 눈에 형광 마커 10 중 하나를 표현하는 haploids을 변환 할 수 있습니다. 선택의 마커 mCherry (A. 존스턴에서 pAJ1661, URA3/CEN)과 융합 세포질로 표현 가용성 GFP (BglII 11 선형화 pEG220, URA3/YIp)와 하나의 ribosomal 단백질, RPL25입니다. 우리는 동등한 두 컬러 정화 프로토콜은 haploid 부모의 세포에 의해 합성 된 다른 밝은 형광 단백질의 사용을 만들 수 기대하고 있습니다. 또한, 세포 벽은 형광 lectins으로 표시 될 수 있습니다.
- 하루 앞 접합자 정화에서 각 셀 타입의 5 ML 문화의 예방과 ° C가 1.0을 초과하지 A600에 도달 할 23 박 흔들림과 함께 성장. 2 %의 포도당 (CSM-포도당)를 포함한 완전한 합성 중간에 GFP의 transformants (ATY4442)을 성장uracil 10 부족 합성 선택적 중간에 차 RPL25 - mCherry의 transformants (ATY4552). 실온에서 흔....
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토론
정화 zygotes의 가용성 zygotes는 또한 세포주기 재입국, 세포 벽 개조, 신진 및 상속 특성 등을 받아야하는가 transcriptomics, 단백질 체학 및 lipidomics뿐만 아니라, 메커니즘에 대한 조사를 포함 생화학 연구를 촉진해야 zygotes가 시작 생성 할 수 하나 또는 둘 모두 부모의 특성 변이를 들고 긴장을 갖추고 있습니다. 또한, 정화 zygotes은 haploid 또는 diploid 세포로, 중간 15 % 글리세롤을 포함하는 동안 얼어있을 수 있으며, 나중에 재발 신진의 측면을 모니터링 할 해동.
미세한 목적에 적합한 다른 형광 마커 (예를 들면 태그 histones 또는 mitochondrial 단백질)를 사용하여 예비 실험 zygotes의 신뢰성 회복을 허용하지 않은,하지만, 비교 정화는 누구의 세포벽 haploid 세포로 시작하는 달성 할 수있을 것입니다 또는 빨간색에 연결되었습니다 녹색 fluorophores. 우리는 S.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
우리는 그림과 도움을 이전 입력 및 일리아 Aylyarov에 대한 유동 세포 계측법, 박사 뿌르 니마 Jaiswal 박사 디 우와 관련하여 도움이 박사 R. 마이클 Sramkoski 감사드립니다. NIH 그랜트 R01GM089872과 세포 계측법 및 사례 종합 암 센터 (P30 CA43703)의 이미징 현미경 핵심 설비의 지원.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 / 장비 | 출처 | 카탈로그 번호 | |
| pEG220, URA3/YIp, 인코딩 세포질 GFP 11) | E. Grote | ||
| pAJ1661, URA3/CEN, mCherry에 융합 인코딩 RPL25 | A. 존스턴 | ||
| 피셔 FB120의 sonicator | 피셔 과학 | ||
| 스트레이너 캡과 폴리 프로필렌 관 | BD 팔콘 | 참조 352,235 | |
| 냉장 microfuge | Tomy | MRX-150 | |
| 유동 세포 계측법의 피복 솔루션 | Biosure | 1027 | |
| iCyt의 반사 모델 흐름 Cytometer | 소니 | ||
| DeltaVision의 deconvolution 현미경 | 응용 Precision | ||
| 입식 epifluorescence 현미경 | Leica | ||
| UltraPure 아가로 오스 | Invitrogen | 15510-07 | |
| CSM 포도당 제제 참고 사항 : 한천 플레이트의 경우는 단순히 2 % 한천 (Difco)를 포함 | 10 |
참고문헌
- Herskowitz, I., Oshima, Y. Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).
- Muller, I. Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae. Antonie Van ....
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재인쇄 및 허가
