골수 이식으로 마우스 대장염에서 면역 및 비 면역 세포에서 유전자 발현의 기능 역할을 차별화

요약

골수 이식은 골수 유래 세포의 유전자형을 변경하는 방법을 제공합니다. 관심 유전자는 골수 유래 세포 및 비 골수 유래 세포 모두에 표현되어있는 경우, 골수 이식이 아닌 골수 유래 세포 유전자형을 변경하지 않고 다른 유전자형에 골수 유래 세포를 변경할 수 있습니다.

초록

대장염의 개발에 유전자의 역할을 이해하기 위해, 우리는 야생 타입 마우스 및 대장염에 대한 유전자 수준의 관심 결함 녹아웃 마우스의 반응을 비교했다. 유전자 수준의 관심은 골수 파생 세포와 호스트의 비 골수 유래 세포 모두에 표시되어있는 경우, 그러나, 골수 유래 세포 및 비 골수의 관심 유전자의 역할을 차별화 할 수 있습니다 골수 이식 기술에 의해 파생 된 세포. 마우스의 골수 유래 세포 유전자형을 변경하려면받는 마우스의 원래 골수는 방사선에 의해 파괴하고 다른 유전자형의 새로운 기증 골수로 대체되었습니다. 야생 형 쥐 기증 골수가 녹아웃 마우스에 이식되었을 때, 우리는 골수 유래 세포의 야생 형 유전자 발현과 녹아웃 마우스를 생성 수 있습니다. 또한,시 녹아웃 마우스 기증 골수는 유전자 수준의 관심을 표현하지 않고 야생 타입받는 마우스, 야생 형 생쥐에 이식 된골수에서 파생 된 세포가 생산되었다. 그러나, 골수 이식이 100 % 완료되지 않을 수 있습니다. 따라서, 우리는받는 마우스 및 골수 이식의 성공에 기증 골수 유래 세포의 비율을 추적하기 위해 기증자와받는 사람 세포의 마커로 차별화 (CD) 분자의 클러스터를 (CD45.1 및 CD45.2) 이용. CD45.2 유전자형과 CD45.1 유전자형과 녹아웃 쥐 야생 형 생쥐가 사용되었습니다. 받는 마우스 조사 후, 다른 genotypes의 기증 골수 세포가받는 마우스에 주입했다. 새로운 골수는 면역을 물려 생성하면, 생쥐는 대장염을 유발하는 화학 물질 에이전트 (dextran 나트륨 황산, DSS 5 %)에 의해 도전되었다. 여기 우리는 또한 마우스로 대장염을 유발하고 뼈 골수 유래 세포에서 표현의 관심 유전자의 역할을 평가하는 방법을 보여 주었다. 뼈 파생 된 세포에서 유전자 수준의 관심은 질병의 발전에 중요한 역할을 (예 : 대장균과 같은 재생되면살은), 골수 이식과 함께받는 생쥐의 표현형이 크게 변경 될 수 있습니다. 대장염 실험의 끝에서, 골수 혈액과 골수의 세포 CD45.1 및 CD45.2에 대한 항체와 라벨이 붙지 만, 존재의의 양적 비율은 유동 세포 계측법에 의한 골수 이식의 성공 여부를 평가하는 데 사용할 수 파생. 성공적인 골수 이식받는 사람 마우스의 골수와 혈액 모두에서받는 사람 유전자형 이상 기증 유전자형 (CD 분자 마커의 기간에)의 대부분을 표시합니다.

프로토콜

1. 전에 - 당신 - 시작 기술 고려 사항

1. 해당 CD 분자와 마우스가 주요 마우스 공급 업체에서 구입 할 수 있기 때문 우리는 실험을 위해 C57/BL6 야생 형 마우스 및 녹아웃 마우스를 모두 사용하는 것이 좋습니다.
2. 이 야생 타입 마우스와 골수 이식 후 기증자의 세포를 파생 녹아웃 마우스를 추적하기가 어렵습니다 때문에, 야생 형 생쥐를 표현하기 위해 CD45.1 마우스를 사용 할 필요가 있습니다. (CD45.1 C57/SJL WT 마우스 잭슨 연구소 주식 # 002014).
3. 대부분의 마우스 식민지가 CD45.2 있습니다. 우리 녹아웃 마우스는 CD45.2 유전자형 (: 잭슨 연구소 주식 # 000664 대안 CD45.2 WT 마우스 소스)에 속한다. CD45.1 또는 CD45.2 유전자형의 결정은이 프로토콜의 제 7에서 설명 드린 바와 같이 골수 및 말초 혈액의 유동 세포 계측법을 사용하여 수행 할 수 있습니다.
4. 조사 후 마우스 면역을 훼손하고있다. 병원체 무료 시설의 생쥐세요.
5. irradiator의 운영 특수 보안 clearanc가 필요합니다전자 및 교육. 교육 및 승인 과정에서 시간을 절약하기 위해, 그것은 irradiator를 작동 할 수 있습니다 자격을 갖춘 기술자와 실험실과 협력하는 것이 가장 좋습니다.
6. 대부분의 기관은 경험이 풍부한 기술자와 유동 세포 계측법 실험실을 갖추고 있습니다. 유동 세포 계측법 운영 문제를 최소화하기 위해, 당신이 시작하기 전에 경험이 풍부한 기술자와 유동 세포 계측법 실험 계획을 논의하는 것이 더 나을 듯합니다.
7. 마우스가이 방식 (그룹 당 10 마우스)에 할당되었습니다

그룹		받는 사람에게 골수 기증	치료
	BM 교환	CD45.1 WT에 CD45.2 KO	DSS 대장염
B			물 정상적인 제어
C	BM 교환	CD45.1 WT에 CD45.2 KO	DSS 대장염
디			물 정상적인 제어
E	가짜	CD45.1 WT에 CD45.1 WT	DSS 대장염
에프			물 정상적인 제어
지	가짜	CD45.2 KO로 CD45.2 KO	DSS 대장염
H			물 정상적인 제어

실험 프로토콜의 * 간단한 그림은 그림 1에 표시됩니다.

2. 받는 마우스의 조사

1. 마우스는 사육과 병원균이없는 시설에 보관됩니다. 필터 autoclaved 조사 파이의 장소는 마우스. 조사 파이의 각 슬롯에 하나의 마우스를 놓습니다. irradiator에 파이를 놓고 턴테이블 파이, 선회되어 있는지 확인하십시오.
2. 공기 펌프를 켜십시오통풍을 위해. irradiator 문을 닫고 닫아.
3. 10 분 (방사선 소스와 반감기에 따라 다름) 주변 1,000 방사선 (10 GY 동일합니다)를 함께 쥐를 비추다. 이 시점에서 방사능 마우스 immuno-위험하고 감염에 대한 면역력 약한 있습니다. 조사 후, 파이를 꺼내와 동물 시설의 바이오 안전성 캐비넷 교통 멸균 용기에 넣습니다. 감염의 기회를 최소화하기 위해 외부 환경에 쥐를 노출하지 마십시오.
4. 바이오 안전성 캐비닛에서 autoclaved 침구 (. - 100 ML 물을 당 3.12 ML을 케이지 당 4 쥐가 sulfatrim 정지와 함께 새로운 멸균 물을 추가)를 autoclaved 마우스 케이지에 쥐를 전송합니다.
5. 항생제는 빛에 민감한만큼 알루미늄 호일로 물 병을 넣어. 케이지에로드하기 전에 잘 sulfatrim 솔루션 병을 섞어 흔들어.

3. 기증자 골수에서 DNA를 추출하는

1. 이산화탄소 또는 isoflur있는 마우스를 희생ance 및 1:200 소독약 솔루션에 다음 잠그다. 피부에 오줌와 오픈 뼈를 해부하는 70 %의 에탄올과 쥐를 스프레이.
2. 살균에 대한 70 %의 에탄올에 절개 악기를 적시 게.
3. 바이오 안전성 캐비닛에 절개를 수행합니다. 근육과 인대를 부착에서 무료로 상완골, 대퇴골, 경골과 비골 뼈를 노출 살균 분해 악기를 사용하십시오.
4. 붉은 골수을 보여 뼈의 양쪽 끝을 잘라 냈어. 집게로 뼈를 잡아. 페트리 접시 3 ML의 주사기와 바늘 25g까지로 차가운 PBS로 적색 골수를 플러시. 더 많은 골수 세포를 얻을 수 있도록 뼈의 양쪽 끝에서 플러시.
5. 반복 흡인과 배출에 의해 적색 골수 플러그를 깨고 6 ML 주사기와 18G1 / 2 바늘을 사용합니다. 50 ML 팔콘 튜브와 골수를 전송합니다.
6. 4에 5 분 ° C.에 1,800 RPM에서 골수를 스핀 다운 5-10 초에 vortexing하여 표면에 뜨는, resuspend 펠렛을 폐기하십시오.
7. 멸균 물 10X RBC의 용해 버퍼를 희석. 광고D 1X RBC 용해 버퍼 (기증자 마우스 당 5 ML), 5 초에 다시 한번 소용돌이, 룸 온도에서 정확히 3 분 유지.
8. 3 분 후, 용해 및 혼합을 중지 할 20 ML 차가운 PBS로 튜브를 채 웁니다. 직접 새로운 50 ML 팔콘 튜브에 40 μm 셀 스트레이너를 통해 콘텐츠를 넣어.
9. PBS의 5 ML을 원래 튜브를 씻어뿐만 아니라 셀 스트레이너에 전송할 수 있습니다. PBS와 혼합있는 50 ML까지 가기.

4. 골수 기증자 셀을 계산

1. Eppendorf 튜브 및 Eppendorf 튜브와 혼합에 골수 정지 100 μl에 Trypan 파랑의 100 μl를 추가합니다. hemocytometer에 스테인드 세포 혼합물을 피펫.
2. 셀의 금액은 매 튜브의 총 생활 골수 세포 수 = 흠없는 전화 번호 16 제곱에서 x 2 (Trypan 푸른 희석으로 인해) × 10,000 X 50 ML에 의해 계산됩니다
3. 4에 5 분 ° C.에 2,000 rpm에서 50 ML 팔콘 튜브에 골수 세포를 스핀 다운
4. 표면에 뜨는을 제거합니다. 기초전체 셀 개수에 ML 당 1 개 10 ⁸ 셀에 PBS로 펠릿을 resuspend

5. 받는 마우스에 주입

1. 열 패드에와 지구 온난화 램프 아래에있는받는 사람 쥐를 따뜻하게. restrainer에받는 사람 쥐를 놔. intravenously 100-200 μl에 마우스 당 1 개 10 ⁷ 세포를 주입.
2. 기증 골수의 주입은 조사 후 4-24 시간 사이에 수행되어야합니다.
3. 케이지 당 4 개의 주입 마우스를 올려. 병원체 무료 동물 시설의 처음 4 주 동안 항생제 - 처리 된 물과 autoclaved 케이지의 주입받는 쥐를 유지하고 쥐가 면역을 회복 보자. 변경 케이지, 항생제 - 처리 물과 음식은 4 일마다 위생을 유지합니다.

6. 대장염의 대장염 및 평가의 유도

1. 사주 조사 및 골수 이식 후 자신의 정상을 회복하기 위해 항생제없이 일반 물로 전환, 2보다 주 동안 쥐를 유지microflora를 약탈.
2. 육주 골수 주입 후 초기 체중을 측정합니다. 일부 마우스는 대장염을 유발 물 광고 libitum를 마시는 5 % dextran 황산 제공됩니다. 일부 마우스는 일반 제어 그룹으로 정기적으로 식수를 제공하고 있습니다.
3. 오일 후, 말초 혈을 인출 헤파린 코팅 튜브 (Vacutainer)에 전송하고 얼음에 유의하시기 바랍니다. 1 관에 4 마우스에서 혈액을 수영장을 보유하고 있습니다. 세포 염색 버퍼 = 600 μl를 300 μl를 혈액 300 μl 조화를 이루고 있습니다. 100 μl 5 개 Eppendorf 튜브, 각각 피를 나눈다.
4. 이산화탄소 또는 isoflurane과 쥐를 희생. 매크로 손상 점수를 (세부 ¹ 다른 주피터 비디오 간행물을 참조하시기 바랍니다) 평가합니다. 체중의 변화를 측정합니다. 디지털 캘리퍼스로 측정 장 길이와 두께. 대변​​ 텍스처 (하드, 소프트 또는 피) 관찰. Hemooccult과 배설물에 잠혈를 결정합니다. 결장 조직을 해부하고 H & E의 착색을위한 포르말린에 고정시킨다.
5. 한 대퇴골 흔적을 해부NE 당 마우스 골수를 추출하고 25g까지 바늘 1 ML의 주사기를 통해 차가운​​ PBS로 골수를 플러시. 풀 네 골수 1 관에 플러그와 얼음에 유의하시기 바랍니다.
6. 더 골수 플러그가 존재하지 않습니다 때까지 페트리 접시, 전단 18G 바늘, 5 ML의 주사기를 여러 번와 골수 플러그에 골수 하거라.
7. 4 ° C.에 5 분에 1,500 RPM과 스핀 다운 표면에 뜨는, 600 μl 세포 염색 버퍼와 resuspend 제거합니다. 100 μl 5 개 Eppendorf 튜브, 각에 resuspended 골수를 나눌 수 있습니다.

7. 유동 세포 계측법에 의한 골수 이식의 품질 검사

1. 혈액 또는 골수 # 1-5의 각 샘플 튜브를 레이블 :
2. 어둠 속에서 각각의 튜브에 대한 항체 혼합물을 준비합니다.

# 1 없음 항체
# 2 30 μl FITC의 isotype 제어 + 30 μl PE isotype 제어 + 15 μl CD16/32 차단
# 3 30 μl FITC CD45.1 AB + 15 μl CD16/32 차단
# 4 30 μl PECD45.2 AB + 15 μl CD16/32 차단
# 5 30 μl FITC CD45.1 AB + 30 μl PE CD45.2 AB + 15 μl CD16/32 차단

혈액 또는 골수 샘플 # 1 아무것도 추가하지

각 혈액 또는 골수 샘플 # 2 항체 혼합물 # 2의 5 μl를 추가합니다

각 혈액 또는 골수 샘플 # 3 항체 혼합물 # 3 3 μl를 추가합니다

각 혈액 또는 골수 샘플 # 4 항체 혼합물 # 4의 3 μl를 추가합니다

각 혈액 또는 골수 샘플 # 5 항체 혼합물 # 5의 5 μl를 추가합니다

3. 30 분에 얼음 어둠 속에서 보관.
4. 각 튜브에 두 ML 1X RBC의 용해 버퍼를 추가합니다. 15 분에 얼음에 어두운에 유의하십시오.
5. 4에 5 분 ° C. 1,500 rpm으로 세포를 스핀 다운 (GH 3.8 회 1,500 RPM = 350 XG) 표면에 뜨는 제거합니다. 어두운 다음, 소용돌이 간략 500 μl 세포 염색 버퍼로 펠렛을 Resuspend.
6. 유동 세포 계측법에 의한 immunostained 혈액과 골수 샘플에 CD45.1 (WT을 대표)와 CD45.2을 (KO를 대표하는) 확인합니다. KO CD45.2을 표현하기 위해 WT CD45.1와 PE를 표현하기 위해 FITC를 선택합니다.
7. FlowJo 소프트웨어 유동 세포 계측법 결과를 분석합니다. PE 비율이나 PE : FITC의 비율을 계산 FITC 비율은 기증 유전자형 피가 골수에서 지배적 인 유전자형인지 여부를 확인합니다.

결과

유전자 수준의 관심이 대장염의 개발 기간 동안 면역 세포에서 중요한 역할을 담당하는 경우, 쥐가 골수 이식 (WT KO 또는 WT에 KO로)를 통해 서로 다른 유전자형의 골수를받는 것은 DSS 대장염에 변경된 응답이 있어야합니다. 대장염의 심각도를 결정하기위한 가장 중요한 매개 변수 중 하나는 colonic 조직의 H & E 염색입니다. Colonic 조직 구조 변화와 염증의 징후는 양적 H & E 조직학 점수 시스템에 의해 평가를 할 수 있습니다. H & DSS의 대장염 모델 E 조직학 점수에 대한 기준은 여기를 ^둘 발견 할 수 있습니다. 또한, 화학 유도 대장염은 trinitrobenzene 설 폰산 (TNBS)로 유도 할 수 있습니다. TNBS의 대장염 유도 및 H & E 조직학 점수 기준의 방법은 이전 발행 ^3에서 찾을 수 있습니다. 그룹 간의 조직 학적 소견으로 점수 차이는 학생의 t-테스트에 의해 분석 할 수 있습니다.

토론

이 골수 이식 접근 방식은 면역학의 대장염의 연구, 감염, 암, 비만 및 기타 질병에 적합합니다. 이 골수 이식 실험은 유전자 수준의 관심은 모두 파생 골수와 비 골수 파생 세포와 유전자 수준의 관심이 어느 인구의 세포에 의해 병을 중재 것으로 의심되는 표현 할 때 필요합니다. 예를 들어, 항균 펩타이드 cathelicidin은 급성 대장염을 조절하기 위해 표시됩니다. 그러나 그것은 상피 세포와 면역 세포 (예 : 대 식세포 등) 모두에 표시됩니다. 그럼 우리가 마우스의 급성 대장염을 변조 세포의 어떤 인구 정의 할 뼈 이식을 사용했습니다. 대장염의 심각성이 크게 골수 이식을 통해 골수 cathelicidin의 genotypes의 변화 이후에 변경되었습니다. 그럼 우리가 DSS에 대한 응답으로 변조 급성 대장염에서 중요한 역할을 담당하고 골수 유래 세포로 표현 그 cathelicidin을 체결 할 수 있습니다.

뼈 mArrow 파생 된 세포는 일반적으로 적혈구, 백혈구와 혈소...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
세포 염색 버퍼	Biolegend	# 420201
10X 적혈구 용해 버퍼	Biolegend	# 420301
FITC 마우스 isotype 제어	Biolegend	# 400207
PE 마우스 isotype 제어	Biolegend	# 400211
PE 안티 - 마우스 CD45.2	Biolegend	# 109807
FITC 안티 - 마우스 CD45.1	Biolegend	# 110705
안티 - 마우스 CD16/32 차단	Biolegend	# 101301
40 μm 셀 스트레이너	Fisherbrand	# 22363547
PBS 1X	MP의 biomedicals	# 1860454
헤파린	Fisherbrand	# BP2425
Sulfatrim (SMZ)	Qualitest	NC9242720 (어부)
소독약 IC	Andwin 과학	NC9745686 (어부)
Vaccutainer	BD	# 8000813
마우스 restrainer	Braintree 과학	# TV-150
Irradiator	JL 목자 사	제가 68A 표시
흐름 cytometer	BD	BD FACSCanto II
흐름 cytometer 테스트 튜브	매	# 352052
디지털 캘리퍼스	Fisherbrand	14-648-17
Hemoccult ICT	Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날	G0328QW