우리는 마우스 태아에 bioactive 대리인의 intratracheal 관리에 대한 새로운 수술 방법을 개발했습니다. 배달 경로는 일반적으로 사용되는 내부 - 양수 주입보다 태아 마우스 폐를 타겟으로 더 효율적입니다. 이 절차는 마우스 모델에서 설명되지 않은 날짜로되어 있습니다.
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방법 논문
태아 마우스 모델에서 Bioactive 에이전트의 Intratracheal 관리를위한 소설 외과 접근
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
세포, 유전자 또는 pharmacologic 요원이 태아 폐 배달 유전자와 획득 질병의 다양한 새로운 치료 전략을위한 기반을 제공 할 수 있습니다. 이외에도 단기 유전자 발현이나 약리 개입이 치료 효과를 달성하기에 충분한 전달 유전자, 여러 가지 비 상속 perinatal 조건의 장기 표현에 대한 요구가있는 선천성 또는 상속 이상에서이에 대한 미래의 징후로 간주됩니다 접근 방식의 종류. 단기 태아 치료의 응용 프로그램에 대한 후보 질병은 신생아 호흡 곤란 증후군의 1,2 또는 신생아 폐 3 hyperoxic 부상의 원인이 계면 활성제 단백질 B의 과도 신생아 결핍이 될 수 있습니다. 영구 치료 교정하기위한 후보 질병은 낭포 성 섬유증 (CF) 4, 계면 활성제의 결함 5 α1-antitrypsin 결핍증 (6)의 유전자 변형입니다. <P 클래스는 = "jove_content"> 일반적으로, 태아 유전자 치료의 중요한 장점은 따라서 개인에 치유 할 수없는 손상을 방지, 환자의 임상 발현 이전에 또는 초기 개발에 치료 개입을 시작하는 능력입니다. 태아에 더 효율적인 유전자 나 줄기 세포 전송을 허용 할 수 성인 기관, 비교 또한, 태아 기관은 증가 세포 증식 속도를 갖추고 있습니다. 또한, 자궁 유전자 전달에 개인의 면역 체계가 완전히 성숙하지 않을 때 수행됩니다. 따라서, 올바른 버전이 아닌 기능이나 결석 단백질의 heterologous 셀이나 보완의 이식은 최근 세포와 유전자를 모두 치료 7의 경우로 입증 된 셀, 벡터 또는 transgene 제품에 면역 sensitization을 야기해서는 안됩니다 .
본 연구에서, 우리는 직접 마우스 m의 태아 기관을 타겟팅 할 가능성을 조사odel. 이 절차는 토끼와 양 팔, 심지어는 임상 설정 9에서와 같이 큰 동물 모델에서 사용하지만, 마우스 모델에서 이전에 수행되지 날짜로되어 있습니다. 등 CF와 같은 유전 질환에 대한 태아 유전자 치료의 가능성을 연구 할 때 마우스 모델 때문에 다른 유전자 변형 마우스 변종, 잘 문서화 embryogenesis와 태아 개발, 덜 엄격한의 넓은 가용성의 증명 개념 첫째로 매우 유용합니다 윤리 규정, 짧은 회임과 대형 쓰레기 크기입니다.
다른 액세스 경로가 간 양수 주입 10-12, 난황 주머니 선박 15,16 또는 배꼽 정맥 17로 (초음파 - 가이드) intrapulmonary 주입 13,14 및 정맥 주사 관리를 포함하여 태아 쥐 폐를 타겟으로 설명되어 있습니다. 우리 소설 수술은 직접 수있는 태아 마우스 기관으로 선택하는 에이전트를 주입 연구자 수기존의 기술 18보다기도에 더 효율적 제공을위한.
프로토콜
1. 원하는 임신 스테이지을 구하는 마우스의 결합
시간 친구 임신 NMRI 마우스를 그들 수술시 임신 18일 (E18) (총 회임 E19.5) 것을. 이전 수술과 이후 그들은 상온 물과 음식을 무료로 이용할 수있는 일반적인 일광에서 필터 상단 케이지에 자리 잡고 있습니다.
2. 태아 Intratracheal (IT) 주입 (그림 1)
- 먼저 1.5 L / 분에서 O 2의 혼합에 isoflurane 1.5 %로 전신 마취에 임신 NMRI 마우스를 제출합니다. isoflurane의 수준은 마우스의 연령과 변형에 따라 다르지만, 일반적으로 isoflurane은 마취 상태에서 동물을 삽입하는 수준에 있어야합니다. 다음 중 체온을 유지하기 위해 (37 ° C) 가열 패드에 임신 마우스를 넣어 수술.
- 전체 외과 수술은 두 외과 의사에 의해 수행됩니다. 한 외과 의사는 임신 마우스와 일의 후속 노출 절개를 수행합니다intratracheal 분사에 대한 전자 태아. 두 번째 외과 의사가 태아 intratracheal 주사 자체를 수행합니다. 수술 절차는 무균 기기 및 무균 기술을 사용하여 수행됩니다.
- povidone 요오드화물과 복부를 소독하고 임신 자궁을 표시 할 수있는 중간 개복술을 수행합니다. 한 번에 하나의 자궁 경적을 외면 화하다와 임신 주머니의 수를 계산합니다. 뿔 당 하나의 태아가에 대한 운영 및 그 이후의 단계에서 태아 머리 exteriorization에 대한 최적의 위치에 따라 선택됩니다. 가장 적합한 태아가 자궁 벽을 통해 시각화으로 선택되어 있습니다. 태아 머리의 코가 (같은 후속 단계 2.5에서 설명) 태아 머리를 노출하고 거꾸로를 수정 한 다음 기관에 삽입됩니다 외과 의사 향해 가리켜 야합니다.
- 먼저 약 1 질 벽을 통해 직경 cm와 태아 멤브레인 (양수 membran의 6-0 폴리 프로필렌 (Prolene) 지갑 문자열 봉합을 전달지역의 전자와 정수리 난황 주머니)이 곳을 나중에 태아 머리에를 통해 노출됩니다. 이 봉합은 어깨부터 자궁 내부에 고정 태아를 유지합니다. 다음 날카로운 가위를 사용하여 약 0.8 cm의 지갑 문자열 내부의 자궁에 절개를합니다.
- 부드럽게 hysterotomy을 통해 태아의 머리와 목을 당겨 요. 목에 부드럽게 꽉 지갑 문자열 봉합를 당겨 2 마이크로 모기 포셉과 위치에서 문제를 해결. 태아 머리가 위턱 주변의 입에 배치 두 집게에 5-0 polyglactin 910 (Vicryl) 봉합에 의해 hyperextension에 저장됩니다.
- 입체 줌 현미경 아래에서 (X10 배율) 태아 기관은 모두 샤프하고 무딘 절개를 사용하여 수직 목 절개하여 시각화합니다. 목 지역의 절개는 약 5 mm 길이입니다. 기본 조직은 더욱기도에 도달 할 무딘 절개를 사용하여 해부 때문입니다 그것은 피상적 절개입니다.
- 을 직접 비전에서 입체 줌 현미경을 통해 30 G 날카로운 바늘로 50 μl 해밀턴 유리 주사기를 사용하여기도에 물질 (예 : 형광 구슬 또는 바이러스 성 벡터)의 30 μl의 총 볼륨을 주입. 바늘을 제거 후, 주입 액체의 최소 유출은 올바른 주사를 보장합니다. 절개는 주입 후 종료되지 않습니다.
- 자궁에 머리를 바꾸려면 코에 부드러운 압력을 적용 할 수 있습니다. 목을 먼저 자궁으로 돌아 간다, 머리가 따라 갔다. 코가 마지막에갑니다. 다음, 지갑 문자열을 강화하여 hysterotomy을 닫습니다. 그런 다음 oligohydramnios을 방지하기 위해 양수 구멍에 생리 솔루션의 약 0.5 ML의 총을 투입. 이렇게하려면 지갑 문자열 내부의 절개에 바늘을 삽입합니다. 다음 생리가 주입되는 후 바늘 주위에 봉합을 닫습니다. 마지막 단계에서는 완전히 P을 종료 한 다음 바늘을 취소문자열을 urse.
- 두개의 레이어에 5-0 Vicryl 실행 봉합과 산모 복벽 (복막 및 내부 및 외부 근육 층)과 피부를 닫습니다. 이후 수술 통증 완화를위한 0.2 % xylocaine으로 절개를 침투. 수술 통증 구호를 위해 - 그것은 buprenorphine를 (0.1 밀리그램 / kg SC 또는 IP 0.05) 사용을 권장합니다. 예방 tocolytics이나 항생제도 사용합니다. 마우스는 가열 패드에 보관됩니다 (37 ° C) 그들은 완전히 회복 될 때까지 (약 1 시간).
3. 태아 간 양수 (IA) 사출
- 2.1 참조
- povidone 요오드화물과 복부를 소독하고 임신 자궁을 표시 할 수있는 중간 개복술을 수행합니다. 한 번에 하나의 자궁 경적을 외면 화하다와 임신 주머니의 수를 계산합니다.
- 이 수행 할 시간이 적게 걸립니다로 IA 주입은 모든 태아에서 수행 할 수 있습니다. 또한, 태아의 위치는 criti 없습니다칼 intratracheal 주사에 비해. 자궁 벽이 반투명이기 때문에, 같은 머리, 다리와 꼬리와 태반 위치로 태아 구조는 잘 볼 수 있습니다.
- 위와 같은 바늘과 주사기를 사용하여 (2.7), 태아 입 주변에 물질의 30 μl를 삽입. 이것은 어느 태아 머리와 forelimbs 사이 또는 낮은 다리와 꼬리 사이에 가장 쉽게 수행 할 수 있습니다. 주입은 더 태아 구조는 분사시 팁과 접촉 없습니다 있도록 바늘의 위치들에 대해 면밀하게 조사한 후에 수행됩니다.
- 자궁이 복부에 재배치되고 복벽과 피부는 (2.9) 위에서 설명한 마감했다.
4. 양념을 넣은 태아의 평가 및 크로스 육성
- 태아 개입 (E19.5에서) 후 승인 안락사 방법 36 시간을 사용하여 댐을 죽여. 추가없이 자궁 경부 전위마취 (pentobarbital, 예를 들어 isoflurane)을 포함 안락사의 모든 다른 형태의 당신은 항상 피하려는 것 태아를 마취 또는 죽하므로 마취는 최선의 방법이 될 것입니다. 제왕 섹션에 의해 운영 -에 태아를 제공합니다. 운영 태아는 자신의 위치가 자궁에서 확인할 수 있습니다. 양수 주머니가 bicornuate 자궁 난소 끝에서 시작 번호가 있습니다.
- (1) 심장 박동, (2) 핑크 피부색 (대 청색증)와 (3) 자발적 움직임의 존재 : 배달 후, 다음과 같은 기준은 태아의 생존 능력을 평가하는 데 사용됩니다. 하루 오래된 새끼를 포함하는 위탁 어머니의 쓰레기에서 이러한 기준을 충족 만 새끼를 놓습니다. 경험으로 우리는 약한 심장 박동, 청색증 피부 색상 및 / 또는 최소한의 자발적인 움직임과 새끼는 종종 위탁 어머니의 쓰레기이나 산모 사람 고기를 먹는 풍습에 의해 거부로 인해 생존하지 않습니다 알아요.
- 배달 O 후IT 또는 IA 분사 (예 : 적색 형광 분자)를 통해 FA 보이는 염료는, 그것은 IT 후 폐에 직접 분사하여 가슴에 ((주입 빨간색 fluospheres에서 핑크 색)이 염료의 존재에 의해 올바른 주사를 보장 할 수 있습니다 사출, 또는 IA 주입 후 폐에 흡입) 또는 복강 (섭취에 의해)에 의해. 이 신생아 쥐 폐와 위의 생체 평가에서을 허용하는 반투명 있다는 사실로 인해 수 있습니다.
- 피하 꼬리으로 위의 중국어 잉크로 정확하게 주입 새끼를 선택합니다. 위탁 어머니의 쓰레기에 4.2에서 언급 된 요건을 충족하는 모든 새끼를 놓습니다.
- 최대 수용하고 운영하는 온 새끼의 생존을 보장하기 위해 위탁 어머니의 쓰레기의 총 (모두 자신의 일일 오래된 새끼뿐만 아니라 크로스 육성 새끼)에 10 개 이상 새끼를 두십시오. 작동 -에서 강아지를 걸기 전에S는 수양 어머니의 쓰레기에, 그녀의 대변과 소변을 모두 비 친숙한 냄새를 숨길 수는 포함 위탁 어머니의 침구 소재를 다룹니다.
- 조용한 환경에서 케이지를 삽입하고 적어도 12 시간 (야간)에 대한 쓰레기를 방해하지 않습니다.
- 다음 날, 수양 어머니의 새끼와 운항 온 새끼 (중국어 잉크로, 다른 새끼들보다 더 작은 평균 표시) 사이의 차이를 만드는 모든 새끼를 세어 육성의 생존 속도를주의 깊게 신고 할 수 있습니다. 엄마의 거부를 방지하고 저체온증을 막기 위해 새끼의 조작 시간을 최소화합니다. 일반적으로, 만약 새끼가 (신생아 새끼의 반투명 특성으로 인해 볼 수있는)은 위의 모든 우유를 갖고 있지 않다면, 환자의 예후 (豫 后)는이 동물의 자세한 생존을 위해 매우 가난합니다.
5. 대표 결과
실험의 전체 체계는 Figur에 묘사되어 있습니다E 2.
intratracheal 분사에 대한 최적의 볼륨의 결정
IT 분사에 대한 최적의 볼륨을 결정하기 위해, 우리는 경험적으로 10 일부터 이르기까지 다양한 볼륨, 20 ~ 30 μl (n은 = 3/volume)을 선택했습니다. 쉽게 감지를 들어, 100 nm의를 파악한 붉은 색 형광 분자를 (fluospheres, 분자 프로브, 라이덴, 네덜란드) 삽입하기로 결정했습니다. E18 오래된 태아의 IT 주입 후, 폐 ° C, 6 μm는 냉동 섹션이 만들어 4에 밤새 4 % paraformaldehyde에 고정, 24 시간 후에 수확했다. 핵 및 고를 필라멘트는 Hoechst 33258 (시그마 - 알드리치, Bornem, 벨기에)와 알렉사 형석 488 phalloidin (Invitrogen, Merelbeke, 벨기에) 각각 실온에서 20 분에 물들했다. 공 촛점 이미지는 칼 Zeiss의 LaserSharp2000.6 소프트웨어와 함께 Biorad 래디언스 2100 공 촛점 현미경을 사용하여 만들어졌다. 상대 형광 (파란색 형광 대표 fluospheres과 핵 stainin에 붉은 색의 비율각각 g는) ImageJ 온라인 소프트웨어를 (그림 3)를 사용하여 정량되었다. 태아 수술시, 역류가 주입 유체의 초과를 나타내는 30 μl를 주입 한 후 검출되었지만 상대적 형광 (분산 분석을 측정하여 정량으로, 30 μl은 폐 실질 조직에서 형광 신호의 최고 금액을했다 , 학생의 t-테스트를 사용하여 각 쌍에 대한 비교 * P <0.05, *** P <0.001).
gastro - 창자 폐 조직과 biodistribution에 fluospheres의 양적 평가
다음, 우리는 IA 사출 비해 IT 후 태아 마우스 폐를 타겟팅의 효율성을 비교 싶었어요. 이렇게하려면 fluospheres의 30 μl은 E18 임신 NMRI 마우스 (N = 5 당 그룹)의 IT 또는 IA 주입 중 후 태아 마우스 폐에 전달했다. IT 분사는 IA에 비해 태아 폐에 fluospheres의 상당히 높은 전송 결과. 경로 (1.43 ± 0.56과 0.05 ± 0.02 상대 형광 (각각 Hoechst에 fluospheres의 비율, 분산 분석, 학생의 t-테스트, *** P <0.001) (도 4 AC). 치료 제어 태아는 형광등의 정상화를 위해 사용되었습니다 배경은 신호. gastro - 창자의 IT와 IA 주입 동물 (그림 4 D) 모두에 긍정적이었다. 더 붉은 형광 치료 태아에서 다른 조직이나 대조군 동물 (데이터가 게재되지 않음)에서 관찰되지 않았습니다.
태아 폐에 rAAV2/6.2 매개 유전자 전달에 따라 intratracheal 및 간 양수 주입의 비교
형광 분자를 주입하여 모두 전달 방법을 비교 한 후, 우리는 IT 및 IA 주입은 rAAV 벡터를 사용한 후 바이러스 전달 및 후속 유전자 발현의 효율성을 평가 싶었어요. rAAV2/6.2 인코딩 반딧불 루시 페라 제 (fLuc) (3x10 10 GC / 태아)닭 β-고를 (CBA) 발기인의 통제하에 E18에서 태아 NMRI 마우스에 IT (n은 = 8) 또는 IA (N = 6) 주입되었다. 제왕 섹션 새끼를 살아남은, 육성은 비 침습적 bioluminescence 이미징 (BLI)에 의해 다음과 시대의 일주 (그림 5)에서 fLuc 활동 (광자 / 초, P / S)에 대한 모니터링 된 후. IT 그룹의 총 광자 플럭스는 IA 그룹과 대조군에서보다 훨씬 높았 (분산 분석, 학생의 t-테스트를 사용하여 각 쌍에 대한 비교 * P <0.05). IA 그룹의 평균 BLI 신호는 부정적인 컨트롤 그룹에서보다 훨씬 더 높은 아니 었습니다.
정확하고 잘못된 태아 intratracheal 분사 사이의 구별
정확하고 incorrectI.T 사이의 구분. 주입은 여러 수준에서 평가 될 수있다. 수술 시간 시점에서, 태아 기관에 분사 동안, 저항은 발견되지 않습니다 때 needl전자는 기관에 위치된다. paratracheal 공간에 주입 할 때 그러나, 더 높은 저항을 알게 될 것입니다. 태아는 반투명이므로 둘째, 제왕 섹션에서,이 폐, 눈에 보이는 염료 (예 : 중국어 잉크, 형광 분자)의 후속 존재를 볼 수 있습니다. 올바른 주사를 평가하는 마지막 옵션은 광학 이미징 더 구체적으로 bioluminescence 이미징입니다. BLI는 리포터 유전자 반딧불의 루시 페라 제의 비 invasively 후속 유전자 발현에 우아한 시스템이지만, 공간 해상도와 해부학 정보는 한정되어 있습니다. 자기 공명 영상 (MRI)는 높은 해상도, 자세한 해부학 적 정보를 포함하는 단층 이미지를 제공합니다. 따라서 우리는 깊은 해부학 구조 (내부 기관)의 시각화와 표면 BLI 신호를 결합 오버레이 이미지를 얻기 위해 MRI와 BLI의 조합을 조사했습니다. 우리의 목적은 지역의 생체 정보에 대한 자세한 확보하는 것이 었습니다잘못된 IT 분사에서 올바른를 구별 할 수 있도록 유전자 표현의 ization.
결합 BL-MR 이미지는 세 후 일주일 (그림 6)에 rAAV2/6.2 CBA-fLuc와 CBA-LacZnls (3x10 각 10 벡터, N = 10 GC / 태아)와 IT를 주입 여러 동물에 인수했다. BL 영상은 목과 가슴 지역에서 나오는 신호를 밝혔다. BLI에 위치한 루시 페라 제 유전자 올바른 주사 (그림 6)에 따라 폐 지역에 표현하지만, 잘못된 주사 (그림 6 B) 후 목 복부 지역 인치와 MRI의 공동 등록 X-여자의 착색에 의한 조직 학적 분석은 생체 공동 등록을 확인했다.
intratracheal 및 간 양수 주입 후 생존
- Fluorospheres
E18 오래된 NMRI의 태아의 전달에 생존은 30 μl 100 nm의 붉은 fluorescen와 IT 또는 IA을 주입t 분자는 두 그룹 100 %이고 태아 수술 (표 1) 후 수확시 살아 주입 태아의 수가 24 시간을 정의했습니다. - rAAV 벡터
태아의 전달에 생존은 각각 85.3 %와 86.3 % (표 1)이었고, 제왕 섹션 36h 후 태아 분사의 시점에서 살아 태아의 수로 정의됩니다 rAAV2/6.2와 IT 또는 IA을 주입. 초기 신생아 생존율은 53.3 % (IT) 각각 74.5 % (IA),이었고, 주입 태아의 초기 번호를 육성 한 후 일일 살아있는 새끼의 수를 상호 연관하여 계산되었다. 이 최종 생존 속도를 얻으려면, 우리는 (1) inhalational 대신 케타민 (75 MG / kg IP)와 medetomidine의 혼합물의 관리의 마취로 isoflurane (1 MG / kg IP)을 사용하여 수술 사망시 수술 절차 프로토콜을 최적화 (2) 수술 중 저체온을 방지하기 위해 가열 패드, (3)입체 줌 현미경 (4) 운영자는 수술로 더 많은 경험이 점점.
1 그림. E18 태아 쥐 Intratracheal 주사가 있습니다.이 그림에서 태아 IT 분사에 대한 수술의 주요 단계는 그려져있다. 첫 번째 단계에서 한 자궁 뿔이 exteriorized 있습니다. 다음 단계에서, 지갑 문자열 봉합은 자궁 벽을 통해 전달하고 지역의 태아 막의은 (양수 막과 정수리 난황 주머니) 여기서 나중에 태아 머리에를 통해 노출됩니다. 다음으로 태아의 머리와 목은 태아 머리가 턱 사이에 두 개의 집게에 5-0 polyglactin 910 봉합사에 의해 hyperextension에 보관되어있는 따라 hysterotomy을 통해 exteriorized 있습니다. 입체 줌 현미경 아래에서 (X10 배율) 태아 기관은 수직 목 incis을 만들어 시각화입니다샤프하고 무딘 절개를 사용하여 이온. 마지막 단계에서 물질의 30 μl의 총 볼륨은 스테레오 줌 현미경을 통해 직접 비전 아래의 기관에 주입되어 있습니다.
그림 2. 실험의 일반 개요.
그림 3. intratracheal 분사에 대한 최적의 볼륨의 결정. IT 분사에 대한 최적의 볼륨을 확인하려면은, 10, 붉은 fluospheres의 20 ~ 30 μl (n은 = 3/volume은) 100 nm의은 E18 오래된 태아에 투여 파악한과 폐는 24 시간을 수확했다 나중에. 핵 및 고를 필라멘트는 각각 Hoechst 33258와 알렉사 형석 488 phalloidin 물들했다. 상대 형광 (fluosph을 대표하는 파란색 형광에 붉은 색의 비율각각 당신이 그렇게 행동 및 핵 염색)는 ImageJ 온라인 소프트웨어를 사용하여 정량되었다. 평균 ± SD, 분산 분석, 학생의 t-테스트를 사용하여 각 쌍에 대한 비교 * P <0.05, *** P <0.001.
4 그림. gastro - 창자 폐 조직과 biodistribution에 fluospheres의 양적 평가는. 붉은 fluospheres의 30 μl이 (가) IT 또는 E18 임신 NMRI 마우스의 (b)는 IA 주입 타겟팅의 효율성을 비교하기 후 태아 마우스 폐에 전달했다 태아 마우스 폐. 치료 제어 태아는 형광 배경 신호의 정상화를 위해 사용되었습니다. 핵 및 고를 필라멘트는 각각, Hoechst 33258와 알렉사 형석 488 phalloidin 물들되었습니다. (C) 파란색 형광에 대한 상대 형광은 (적색의 비율 fluosp을 대표하는각각 heres 및 핵 염색)는 ImageJ 온라인 소프트웨어를 사용하여 정량되었다. (D) gastro - 창자의 IT와 IA 주입 동물 모두에 긍정적이었다. 평균 ± SD, 분산 분석, 학생의 t-테스트, *** P <0.001. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. 태아 폐에 rAAV2/6.2 매개 유전자 전달에 따라 intratracheal 및 간 양수 주입의 비교. 총 광자 플럭스의 상응하는 정량화와 rAAV2/6.2의 주입 (3 × 10 10 GC / 태아 CBA-fLuc) 후 1 주일에서 BLI 신호 . 모든 동물은 스캔 된, 이웃 동물 광자의 분산을 방지하기 위해, 검은 파티션으로 구분합니다. pseudocolor 규모는 초당 광자 자속을 묘사, steradian (P / S / cm 2 / SR) 당 cm2 당. 측정은 관심있는 4.3 cm 두 직사각형 영역에서 얻은되었습니다. 평균 ± SD, 분산 분석, 학생의 t-테스트를 사용하여 각 쌍에 대한 비교 * P <0.05. Carlon 외., 2010에서 적응 그림. Macmillan 출판사 (주)의 허가에 의해 재 : [분자 치료] (아프게 : 10.1038/mt.2010.153), 저작권 (2010). 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
6 그림. 태아 폐에 rAAV2/6.2 매개 유전자 전달에 따라 정확하고 잘못된 태아 intratracheal 분사 사이의 차이는. rAAV2/6.2 CBA-fLuc와 CBA-LacZnls (3x10 10로 IT를 주입 BL-MR 이미지는 여러 가지 동물에 인수 된 복합 GC / 각 vecto에 대한 태아R) 세 후 일주일에서. BL 영상은 목과 가슴 지역에서 나오는 신호를 밝혔다. BLI에 위치한 루시 페라 제 유전자 올바른 분사 (A)에 따라 폐 지역에 표현하지만, 잘못된 분사 (B) 후 목 복부 지역 인치와 MRI의 공동 등록 조직 학적 분석은 생체 공동 등록에 있음을 확인했습니다. 스케일 바 = 100 μm. Carlon 외., 2010에서 적응 그림. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
| 사출 물질 | 사출 방법 | 인도에 생존 | B를 육성 생존율 | 초기 신생아 생존 율 C |
| fluospheres | IT | 100 (8분의 8) | NA | NA |
| IA | 100 (5 / 5) | NA | NA | |
| rAAV2/6.2 | IT | 85,3 (75분의 64) | 62,5 | 53,3 (75분의 40) |
| IA | 86,3 (51분의 44) | 86,4 | 74,5 (51분의 38) |
표 1. 태아 intratracheal 및 간 양수 주입 후 존속. 태아 수술 후 및 제왕 섹션에 전달, 즉에 생존이 육성 전에. 사람들이 분홍색이라면 B 형 새끼 만 육성 된, 이동하고 호흡도 정상. C는 초기 신생아 생존율하는 것은 표현 주입 새끼의 초기 숫자의 함수로. 약어 : IT Intratracheal 사출, IA 간 양수 주입, NA 적용 할 수 없습니다.
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토론
중요 단계
- 그들은 새끼의 풍부한 수 (평균 쓰레기 크기 14.4 ± 1.8, 자신의 데이터)를 가지고 있기 때문에 우리가 함께 작동하도록 선택 마우스 스트레인 NMRI 마우스입니다 잘 개입을 용인하고 좋은 어머니의 특성을 갖추고 있습니다.
- 만 외상을 유발하지 않고 거의 불가능 그렇지 않으면 재배치, 태아 머리가 아닌 어깨를 노출 원하는대로 자궁 벽과 태아 멤브레인을 통해 지갑 문자열을 배치하는 것은 중요한 단계입니다.
- 태아 머리의 최적의 위치는 큰 혈관 (목 혈관) 기관과 병렬 실행 방지 있도록 하위 정확히 기관 위의 절개를 할 필수적입니다되었다.
- 그것은 시각적으로 잘못된 주사를 피하기 위해 수술 현미경으로 태아 기관에 바늘의 삽입을 수행하는 것이 중요합니다.
- 외상을 유발하지 않고 자궁 주머니에 태아 머리를 교체하면 같은 중요내부 - 자궁 또는 출생 후의 사망률을 증가 태아 머리를, 부상 방지하고 싶습니다.
- 이 부정적인 ...
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공개 사항
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감사의 글
MC와 AVdP는 플랜더스의 과학 기술 (IWT-Vlaanderen)을 통해 혁신의 추진 연구소에서 보조금에 의해 지원 박사 동문 있습니다. JT는 UZ Leuven에서 파트 타임 임상 연구 휄로 십 (KOOR)를 보유하고 있습니다. DV는 구 Leuven, DBOF/10/062의 교부금으로 지원하는 박사 동료입니다. MMdC는 Conselho Nacional 드 Pesquisa 전자 Desenvolvimento (CNPq)와 에라스무스 (Erasmus) Mundus의 교부금으로 지원하는 박사 동료입니다. 연구는 EC 부여 DIMI (LSHB-CT-2005-512146)와 구 Leuven에서 생체 분자 이미징 연구 그룹 (IMIR)에 의해, IWT-Vlaanderen로 운영되었습니다. 우리는 rAAV 벡터 생산을위한 플라스미드 AAV6.2 포장의이 같은 선물 제임스 M. 윌슨에 의해 설립 UPenn 벡터 코어를 인정하고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 (선택 사항) |
| NMRI 마우스 | 비어 르 Genest 세인트 섬, 프랑스 | ||
| Isoflurane | Isoba, Intervet / Schering-북두칠성 동물 건강, 밀턴 케인즈, 영국 | ||
| Prolene 6-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, 벨기에 | ||
| Vicryl 5-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, 벨기에 | ||
| 50 μl 해밀턴 유리 주사기, 모델 1710.5 TLLX SYR | 해밀턴, 리노, 네바다, 미국 | 5495-20 | |
| 30g의 날카로운 바늘 | 해밀턴, 리노, 네바다, 미국 | 7762-03 | |
| 2퍼센트 xylocaine | 아스트라 제 네 카, Zoetermeer, 네덜란드 |
참고문헌
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