태아의 프로그래밍 셀 죽음을 감지 할 LysoTracker의 이용 및 배아 줄기 세포를 차별화

요약

우리는 마우스 배아의 프로그래밍 세포 죽음의 영역 (PCD)와 LysoTracker라는 높은 가용성 염료를 사용하여 배아 줄기 (ES) 세포 문화를 차별화를 시각화하는 간단한 프로토콜을 제시한다.

초록

프로그래밍 세포 죽음 (PCD)는 일반 조직 항상성을 유지하고 embryological 개발하는 동안 조직과 장기 ^1,2,6,7를 형성하기 위해 성인에서 발생합니다. 개발하는 동안 독성 화학 물질이나 유전자 변이가 PCD 증가 시키거나 발달 이상이나 기형아 출산은 ^3-5의 결과 PCD 패턴을 변경할 수 있습니다. 이러한 결함의 병인을 이해하기 위해서는 배아의 연구는 배아 줄기 (ES) 세포를 차별화 사용하는 체외 assays에 구비 할 수 있습니다.

Apoptosis는 caspase 효소 폭포를 활성화 신호 고유와 외부를 모두 포함 PCD의 잘 공부 형태입니다. 특성 세포 변화가 막 blebbing, 원자력 축소, 그리고 DNA의 조각이 포함되어 있습니다. PCD의 다른 형태의 caspase 활성화를 포함하지 않고 장시간 autophagy의 최종 결과 일 수 있습니다. 상관없이 PCD 경로의, 죽어가는 세포를 제거해야합니다. 성인에서 면역 세포 완벽하게태아에 면역 체계가 아직 발달되지 않은 곳, 제거 다른 메커니즘에 의해 발생하는 동안이 기능을 ORM. 이 메커니즘은에 복용 이웃 세포를 ( "비 전문 phagocytes")를 포함 phagocytic 역할들이 죽어 셀 빨아들이다 그것에게 ^8-10를의 표면에 신호 '내 식사'를 인식하고 있습니다. engulfment 후, 그 잔해가 저하의 lysosome로 이동합니다. 따라서 관계없이 PCD 메커니즘, lysosomal 활동의 증가는 증가 세포 죽음과 상관 될 수 있습니다.

PCD, 두꺼운 조직 및 다층 차별화의 문화권에서 리소좀을 시각화하는 간단한 분석을 공부하려면 유용 할 수 있습니다. LysoTracker의 염료는 lysosome ^11-13로 산성 subcellular 구획에서 유지되는 높은 가용성 작은 분자이다. 염료는 확산 의해 순환 통해 이루어집니다. 침투는 두꺼운 조직 및 멀티 레이어 문화에 PCD의 방해, 시각화 아니므로 ^12,13 수 있습니다 14, 작은 샘플, 조직 학적 부분, 그리고 monolayer 문화로 제한됩니다.

diffuses 및 용매에 의해 용해되어 아닐린 블루, 대조적으로, LysoTracker 레드 DND-99은 고칠 밝고 안정적​​입니다. 착색는 전체 마운트 또는 수성이나 솔벤트 기반의 설치 미디어 ^12,13를 사용하여 섹션의 표준 형광 또는 공 촛점 현미경으로 시각화 할 수 있습니다. 여기 정상과 음속의 고슴도치 널 마우스 배아에서 PCD 볼이 염료를 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 ES 세포의 문화를 차별화의 PCD의 분석을 보여줍니다 및 간단한 정량화 방법을 제시한다. 요약하면, LysoTracker의 착색은 PCD을 검출 다른 방법에 큰 보완 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 마우스 태아의 LysoTracker의 착색

1. 남성 스터드 케이지에 젊은 (성인 5-6 일주일 정도) 여성을 배치하여 마우스 배아를 생성합니다. 그 결합을 나타내는 질 플러그의 모양에 대한 다음과 같은 아침에 모니터가 발생했습니다. 여성의 임신 인 경우 그 날의 정오에는 0.5 dpc (일 게시물 성교)라고합니다. 여기에 제시된 절차는 배아 7-13 dpc에 이상적입니다.
2. 관심 배아 일에 승인 된 프로토콜에 따라 여성을 안락사시켜야과 자궁을 제거합니다. 행크스 BSS (페놀 레드 제외) 10cm 배양 접시에 decidua에서 배아를 제거합니다. 추가 - 배아 세포막을 제거하고 적어도 하나는 관계없는 조직과 혈액을 제거 할 행크스 BSS와 린스 않습니다.
3. LysoTracker의 배아 착색 솔루션 (행크스 BSS 5 밀리미터 LysoTracker)를 준비합니다. 1-2 litters을위한 편리한 볼륨은 5 ML입니다. 부드럽게 골고루 염료를 지출 할 수 섞는다.
4. LysoTracker의 배아 착색의 Solut에 배아를 추가합니다45 분의 microfuge 튜브 또는 37 ° C에서 유리 병 및 배양에 이온.
5. 행크스 BSS에서 매우 부드럽게 네 번, 5 분마다 빨래를 헹굴.
6. 밤새 4 % ....

토론

apoptosis의 중요한 특징은 caspase 활동의 검출과 함께 TUNEL 분석과 DNA 손상의 검출 (mAbs 또는 ZVAD-fmk으로 구속력 분자를 감​​지), 세포 변화의 관찰, 그리고 phosphatidylserine의 표현 (PS를 포함 막 표면에) (Annexin V 구속력을 감지). 이러한 assays의 각 몇 가지 단점이 있습니다. 예를 들어, TUNEL 분석에 사용 transferase 터미널은 몇 세포 층 이상 침투하지 않습니다. 또한 Annexin V는 막 손상 (Annexin V는 세포 안으로 숨는 내부 전단지에 PS를 표시)가있는 것으로 apoptosis를 겪고되지 않은 셀을 표시 할 수 있습니다. 또한 caspase의 assays는 apoptosis에 연결되어 있지 않습니다 caspase 활동을 감지 할 수 있습니다. LysoTracker이 assays를 대체 할 수 없습니다, 그러나 그것은 상황에 따라 유용한 보완 분석 할 수 있습니다.

Lyso.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약의 이름	회사		카탈로그 번호
LysoTracker 레드 DND-99	Invitrogen	# L-7528
행크스 BSS	Invitrogen	14025-076
Paraformaldehyde	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	벡터	H-1200
DMEM	Cellgro	10-013 - CV
비 필수 아미노산	Cellgro	25-025 - CI
나트륨 pyruvate	Cellgro	25-000 - CI
FBS	Hyclone	SH30071.02
펜 패 혈성	Invitrogen	15140-122
B-메르 캅토 에탄올, 50 MM	Invitrogen	21985-023
LabTek-II 상공 회의소 슬라이드 (8도)	Nalge Nunc 인터내셔널	154534
젤리 0.1 %	Millipore	ES-006-B
Dulbecco의 PBS (D-PBS)	Cellgro	21-031 - CV
			솔루션 요리법 4 % Paraformaldehyde 100 ML는 다음과 같습니다 4g의 paraformaldehyde, 90 ML H 2 O와 NaOH를 (2N NaOH의 드롭) 섞는다. 당신은 pH를 높이기 위해 몇 가지 NaOH를 추가 할 때까지 paraformaldehyde이 솔루션으로 이동하지 않습니다. 60 저어와 열 ° C 모든 가루가 솔루션 (~ 10-20 분)에까지. 과열하지 마십시오. 100 ML의 최종 볼륨을 달성하기 위해 ~ 10 ML 10X PBS를 추가합니다. 편리 (~ 10 ML 또는 ~ 40 ML) aliquots에서 -20 ° C에서 저장합니다. 경고 : '주름'양식 (작은 알약을 압축)에서 Paraformaldehyde이 덜 가루이며, 따라서 후드의 외부 측정 할 수 있습니다. 하지만 당신은 여전히 보호 먼지 마스크 (N95를 착용해야합니다이상) 처리하는 동안. EB 문화 미디어 500 ML EB 미디어를 들면 : DMEM : 404.5 ML FBS : 75.0 ML L-글루타민 : 5.0 ML 페니실린은 / 스트렙토 마이신 : 5.0 ML 비 필수 아미노산 : 5.0 ML 나트륨 pyruvate : 5.0 ML β-메르 캅토 에탄올 : 500μl