생화학적으로 정의된 대형 단일층 소포(LUVs)는 BCL-2 family 상호작용을 분석하기 위한 편리한 모델 시스템이며, 이는 세포 자살의 미토콘드리아 경로를 더 잘 이해하는 데 즉각적인 영향을 미칩니다. LUVs를 제조하는 방법과 함께, LUV 투과화를 조사하기 위한 표준 BCL-2 family 단백질 조합 및 대조군이 제시됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) 패밀리는 세포 생존을 유지하거나 세포 사멸을 유도하기 위해 협력하는 약 20가지의 단백질로 구성됩니다1. 세포 스트레스(예: DNA 손상)가 발생하면, 전-세포사멸 BCL-2 패밀리 작동체인 BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) 및/또는 BAX (BCL-2 associated X protein)가 활성화되어 미토콘드리아 외막 투과성 증가(MOMP)라고 불리는 과정을 통해 미토콘드리아 외막(OMM)의 무결성을 손상시킵니다1. MOMP가 발생하면 전-세포사멸 단백질(예: cytochrome c)이 세포질로 유출되어 caspase 활성화를 촉진하며, 이후 빠르게 세포 사멸이 진행됩니다2.
BAK/BAX가 MOMP를 유도하기 위해서는 BID (BH3-interacting domain agonist)와 같은 BCL-2 가문의 또 다른 전-세포사멸(pro-apoptotic) 하위 집단인 BCL-2 상동 도메인 3 (BH3)-only 단백질들과의 일시적인 상호작용이 필요합니다3-6. 항-세포사멸(anti-apoptotic) BCL-2 가문 단백질(예: BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1)은 BAK/BAX와 BAK/BAX 활성화를 직접 유도할 수 있는 BH3-only 단백질 간의 상호작용을 엄격하게 조절함으로써 세포 생존을 조절합니다7,8. 또한, 항-세포사멸 BCL-2 단백질의 가용성은 항-세포사멸 구성 요소와 결합하여 이를 억제하는 BAD (BCL-2 antagonist of cell death) 또는 PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis)와 같은 감작제/탈-억제제(sensitizer/de-repressor) BH3-only 단백질에 의해 결정됩니다7,9. 대부분의 항-세포사멸 BCL-2 레퍼토리가 OMM에 국소화되어 있으므로, 생존을 유지하거나 MOMP를 유도하려는 세포의 결정은 이 막에서의 다중 BCL-2 가문 상호작용에 의해 결정됩니다.
거대 단일막 소포(Large unilamellar vesicles, LUVs)는 BCL-2 가족 단백질 간의 상호작용과 막 투과성 사이의 관계를 탐구하기 위한 생화학적 모델입니다10. LUVs는 용매 추출된 Xenopus 미토콘드리아의 지질 조성 연구에서 확인된 비율(46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, 7% cardiolipin)로 조립된 특정 지질들로 구성됩니다10. 단백질과 지질 성분이 완전히 정의되어 있고 조절 가능하므로, 항상 그렇지는 않은 일차 미토콘드리아와 달리 BCL-2 가족의 기능을 직접적으로 탐구하기에 편리한 모델 시스템입니다. 일반적인 OMM 전체에서 cardiolipin의 함량이 이 정도로 높지는 않으나, 이 모델은 BCL-2 가족의 기능을 촉진하기 위해 OMM을 충실히 모사합니다. 또한, 위 프로토콜의 최신 수정 버전에서는 다가 음이온 염료(ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid)와 양이온 소광제(DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)를 포함하는 LUVs를 기반으로 하여, 단백질 상호작용의 역학적 분석과 막 투과성의 실시간 측정이 가능합니다11. LUVs의 투과성이 높아지면 ANTS와 DPX가 서로 확산되어 멀어지며, 이에 따라 형광 강도의 증가가 검출됩니다. 본 문서에서는 ANTS/DPX를 포함하는 LUVs를 이용한 일반적인 재조합 BCL-2 가족 단백질 조합 및 대조군 설정 방법을 설명합니다.
프로토콜
1. 지질 혼합 및 지질 박막 형성
- 조명이 최소화된 흄 후드 내에서, 클로로포름으로 헹군 Hamilton 가스 타이트 유리 시린지를 사용하여 클로로포름에 용해된 지질들을 1.5 ml 갈색 유리 바이알에 혼합합니다. 이 혼합 과정을 통해 약 4 mg의 지질이 생성됩니다(그림 1A).
- Cardiolipin 10 mg/ml (CL) - 63 μl
- Phosphatidylcholine 10 mg/ml (PC) - 84 μl
- Phosphatidylethanoloamine 10 mg/ml (PE) - 125 μl
- Phosphatidylinositol 10 mg/ml (PI) - 59.5 μl
- Phosphatidylserine 10 mg/ml (PS) - 65 μl
- 클로로포름을 제거하기 위해, 바이알 내부에 불활성 가스(예: 질소 또는 아르곤)를 부드럽게 분사합니다. 건조되면 바이알의 바닥과 측면에 지질 막이 보이게 되며, 이 과정은 보통 2 - 3시간이 소요됩니다(그림 1A).
2. 리포좀 용액 준비
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토론
설명된 LUV 생성 방법은 OMM과 유사한 생화학적으로 정의된 막 환경에서 다양한 BCL-2 가족 단백질, 펩타이드 및 관련 시약의 기능을 테스트할 수 있는 신속하고 효율적인 수단을 제공합니다. LUV 투과성을 결정하기 위해 종점 값을 사용하는 경우, 여러 개의 플레이트를 설정하여 단 하루 만에 수백 가지 조건을 분석할 수 있습니다. 이러한 분석에서 제한 요인이 되는 시약은 주로 재조합 단백질의 품질과 양이므로, 단백질 정제에 충분한 시간과 자원을 투자해야 재현성 있는 LUV 분석 결과를 얻을 수 있습니다.
저희의 경험에 따르면, LUV를 4 °C 암소에 보관했을 때 일반적으로 최대 2주 동안 BAX 및 BID에 반응합니다. 그러나 재조합 BCL-2 단백질은 더 불안정하며 여러 차례의 냉동/해동 반복 후 활성이 현저하게 변화하기 쉽습니다. 따라서 단백질 스톡은 가능한 가장 높은 농도로 유지하며 -80 °C에서 소량으로 분주하여 보관하고, 사용 직전에 희석할 것을 권장합니다. 이.......
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공개 사항
선언된 이해상충 없음.
감사의 글
동료애와 지지를 보내준 Chipuk 실험실의 모든 구성원에게 감사를 표합니다. 또한, 본 연구의 실험적 토대를 마련해 준 Tomomi Kuwana와 Donald Newmeyer에게 감사의 마음을 전합니다. 본 연구는 NIH CA157740 (J.E.C. 수혜) 및 NIH P20AA017067 (J.E.C. 수혜)의 파일럿 프로젝트 지원을 받아 수행되었습니다. 또한, 본 연구의 일부는 March of Dimes Foundation의 연구비 5-FY11-74 (J.E.C. 수혜)의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosph–thanolamine "PE" | Avanti | 850725C | |
| L-α-Phosphatidylcholine (닭 알) "PC" | Avanti | 840051C | |
| L-α-Phosphatidylinositol (소 간) "PI" | Avanti | 840042C | |
| L-α-Phosphatidylserine (돼지 뇌) "PS" | Avanti | 8400320 | |
| Cardiolipin (소 심장 - 나트륨염) "CL" | Avanti | 840012C | |
| 미니 압출기 세트 | Avanti | 610023 | |
| PC 멤브레인 0.2 mM | Avanti | 610006 | |
| Costar 블랙 96웰 플레이트 | Fisher Scientific | 07-200-590 | |
| Caspase-8 절단 인간 BID | R&D Systems | 882-B8-050 | |
| 인간 BCL-xL (C-말단 제외) | R&D Systems | 894-BX-050 | |
| BID/PUMA BH3 도메인 펩타이드 | Anaspec | 61711/62404 | |
| Synergy H1 하이브리드 멀티모드 마이크로플레이트 리더 | BioTek | None |
참고문헌
- Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol. Cell. 37, 299-310 (2010).
- Green, D. R. Apoptotic pathways: ten minutes to dead. Cell. 121, 671-674 (2005).
- Gavathiotis, E.
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