생화학적으로 정의된 대형 단일층 소포(LUVs)는 BCL-2 family 상호작용을 분석하기 위한 편리한 모델 시스템이며, 이는 세포 자살의 미토콘드리아 경로를 더 잘 이해하는 데 즉각적인 영향을 미칩니다. LUVs를 제조하는 방법과 함께, LUV 투과화를 조사하기 위한 표준 BCL-2 family 단백질 조합 및 대조군이 제시됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) 패밀리는 세포 생존을 유지하거나 세포 사멸을 유도하기 위해 협력하는 약 20가지의 단백질로 구성됩니다1. 세포 스트레스(예: DNA 손상)가 발생하면, 전-세포사멸 BCL-2 패밀리 작동체인 BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) 및/또는 BAX (BCL-2 associated X protein)가 활성화되어 미토콘드리아 외막 투과성 증가(MOMP)라고 불리는 과정을 통해 미토콘드리아 외막(OMM)의 무결성을 손상시킵니다1. MOMP가 발생하면 전-세포사멸 단백질(예: cytochrome c)이 세포질로 유출되어 caspase 활성화를 촉진하며, 이후 빠르게 세포 사멸이 진행됩니다2.
BAK/BAX가 MOMP를 유도하기 위해서는 BID (BH3-interacting domain agonist)와 같은 BCL-2 가문의 또 다른 전-세포사멸(pro-apoptotic) 하위 집단인 BCL-2 상동 도메인 3 (BH3)-only 단백질들과의 일시적인 상호작용이 필요합니다3-6. 항-세포사멸(anti-apoptotic) BCL-2 가문 단백질(예: BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1)은 BAK/BAX와 BAK/BAX 활성화를 직접 유도할 수 있는 BH3-only 단백질 간의 상호작용을 엄격하게 조절함으로써 세포 생존을 조절합니다7,8. 또한, 항-세포사멸 BCL-2 단백질의 가용성은 항-세포사멸 구성 요소와 결합하여 이를 억제하는 BAD (BCL-2 antagonist of cell death) 또는 PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis)와 같은 감작제/탈-억제제(sensitizer/de-repressor) BH3-only 단백질에 의해 결정됩니다7,9. 대부분의 항-세포사멸 BCL-2 레퍼토리가 OMM에 국소화되어 있으므로, 생존을 유지하거나 MOMP를 유도하려는 세포의 결정은 이 막에서의 다중 BCL-2 가문 상호작용에 의해 결정됩니다.
거대 단일막 소포(Large unilamellar vesicles, LUVs)는 BCL-2 가족 단백질 간의 상호작용과 막 투과성 사이의 관계를 탐구하기 위한 생화학적 모델입니다10. LUVs는 용매 추출된 Xenopus 미토콘드리아의 지질 조성 연구에서 확인된 비율(46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, 7% cardiolipin)로 조립된 특정 지질들로 구성됩니다10. 단백질과 지질 성분이 완전히 정의되어 있고 조절 가능하므로, 항상 그렇지는 않은 일차 미토콘드리아와 달리 BCL-2 가족의 기능을 직접적으로 탐구하기에 편리한 모델 시스템입니다. 일반적인 OMM 전체에서 cardiolipin의 함량이 이 정도로 높지는 않으나, 이 모델은 BCL-2 가족의 기능을 촉진하기 위해 OMM을 충실히 모사합니다. 또한, 위 프로토콜의 최신 수정 버전에서는 다가 음이온 염료(ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid)와 양이온 소광제(DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)를 포함하는 LUVs를 기반으로 하여, 단백질 상호작용의 역학적 분석과 막 투과성의 실시간 측정이 가능합니다11. LUVs의 투과성이 높아지면 ANTS와 DPX가 서로 확산되어 멀어지며, 이에 따라 형광 강도의 증가가 검출됩니다. 본 문서에서는 ANTS/DPX를 포함하는 LUVs를 이용한 일반적인 재조합 BCL-2 가족 단백질 조합 및 대조군 설정 방법을 설명합니다.
프로토콜
1. 지질 혼합 및 지질 박막 형성
- 조명이 최소화된 흄 후드 내에서, 클로로포름으로 헹군 Hamilton 가스 타이트 유리 시린지를 사용하여 클로로포름에 용해된 지질들을 1.5 ml 갈색 유리 바이알에 혼합합니다. 이 혼합 과정을 통해 약 4 mg의 지질이 생성됩니다(그림 1A).
- Cardiolipin 10 mg/ml (CL) - 63 μl
- Phosphatidylcholine 10 mg/ml (PC) - 84 μl
- Phosphatidylethanoloamine 10 mg/ml (PE) - 125 μl
- Phosphatidylinositol 10 mg/ml (PI) - 59.5 μl
- Phosphatidylserine 10 mg/ml (PS) - 65 μl
- 클로로포름을 제거하기 위해, 바이알 내부에 불활성 가스(예: 질소 또는 아르곤)를 부드럽게 분사합니다. 건조되면 바이알의 바닥과 측면에 지질 막이 보이게 되며, 이 과정은 보통 2 - 3시간이 소요됩니다(그림 1A).
2. 리포좀 용액 준비
- 1.7 ml 마이크로원심분리 튜브에 LUV 버퍼(0.2 mM EDTA, 10 mM HEPES [pH 7], 200 mM KCl, 5 mM MgCl2 )로 조제한 500 μl의 12.5 mM ANTS와 500 μl의 45 mM DPX를 각각 준비합니다(그림 1B).
- ANTS 용액과 DPX 용액을 혼합한 후, 실온에서 1분간 볼텍싱하고 1분간 초음파 처리합니다. 초음파 처리는 초음파 세척기(예: Branson 3510MTH, 별도 설정 없이 'on' 상태)를 사용하여 수행합니다. 이를 통해 용액이 완전히 가용화되어 균질하게 섞이도록 합니다.
- 지질 박막(lipid film)에 ANTS/DPX 용액을 첨가하고, 바이알을 파라필름으로 밀봉합니다(그림 1B).
- 위에서 사용한 초음파 세척기로 지질 박막을 5분간 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후 용액은 우윳빛으로 변합니다. 작은 지질 응집체가 형성되면 후속 단계에 부정적인 영향을 미치므로 지질 박막이 완전히 가용화되었는지 확인하십시오. 또한, 바이알의 측면과 바닥에 남아 있는 지질 박막이 없는지 확인합니다(그림 1B).
3. 리포좀의 압출 및 정제
- 제조업체의 지침에 따라 LUV 버퍼를 사용하여 필터 지지대와 폴리카보네이트 막을 적신 후 압출기를 조립합니다. 압출 과정 중 부피 손실이 없도록 장치 케이싱을 조이되, 막이 파손되지 않도록 너무 세게 조이지 마십시오. 또한, LUV 버퍼로 압출기를 테스트하여 누출이나 문제가 없는지 확인하는 것이 좋습니다.
- 지질 용액을 오른쪽 시린지에 넣고 지질 용액을 31회 압출하면, LUV가 왼쪽 시린지에 모이게 됩니다. 이를 통해 모든 지질이 최소 한 번 이상 막을 통과하도록 합니다. 처음 몇 번은 막을 통과하기 위해 약간 더 많은 압력이 필요할 수 있습니다. 용액이 갑자기 막을 빠르게 통과하는 경우, 막의 파손 여부를 확인하고 필요 시 교체하십시오 (Figure 1C).
- 10 ml Sepharose S-500 중력 흐름 컬럼(1.0 cm x 20 cm, 비드 부피 10 ml)을 설치합니다. LUV 버퍼 3컬럼 부피로 세척하고, 컬럼 흐름이 멈추면 캡을 씌웁니다. 이 단계는 시간이 다소 소요되므로 지질을 혼합하여 건조시키는 동안 세척을 시작하는 것이 좋습니다. 사용 준비가 될 때까지 컬럼의 캡을 씌운 상태로 유지하십시오.
- 압출된 LUV를 비드 인터페이스가 흐트러지지 않도록 주의하며 한 번에 컬럼에 넣습니다. 버퍼가 컬럼 밖으로 다 흘러나와 흐름이 멈추면 플러그를 꽂습니다. LUV 버퍼로 컬럼을 천천히 채웁니다. 이때 다시 한번 비드가 흐트러지지 않도록 버퍼를 추가할 때 주의하십시오 (Figure 1C).
- 플러그를 제거하고 1 ml씩 6개 분획을 수집합니다. LUV는 일반적으로 3번과 4번 분획에서 용출되며, 뿌연 외관으로 확인할 수 있습니다. 분획 수집이 완료되면 컬럼을 증류수 5부피와 20% 에탄올 2부피로 세척합니다. 컬럼은 4 °C에서 보관하십시오 (Figure 1C).
- 수집한 분획은 테스트 전까지 4 °C의 암소에 보관하십시오.
4. 컬럼 분획 테스트
- 이제 LUV 버퍼와 0.5% CHAPS가 첨가된 LUV 버퍼를 비교하여 컬럼 분획의 형광을 테스트합니다. CHAPS의 존재로 인해 형광이 증가하는 분획에 LUV가 포함되어 있습니다. LUV 버퍼 또는 LUV 버퍼 + 0.5% CHAPS를 각각 6개의 웰에 100 μl씩 분주하고, 해당 분획 5 μl를 추가하여 혼합합니다. 모든 LUV 연구에는 불투명한 검은색 무처리 96-웰 플레이트를 사용합니다 (Figure 1D).
- 다음 파라미터를 사용하여 37 °C에서 플레이트를 측정합니다: 들뜸 파장: 355 nm; 방출 파장: 520 nm; 게인(전압): 125; 광학 위치: Top; 측정 높이: 5.5 mm. 이 설정은 Gen 5 2.0 소프트웨어를 사용하는 BioTek H1 Synergy 기준입니다 (Figure 1D).
- 일반적으로 분획 3과 4에서 형광이 5 ~ 10배 증가합니다. 분석이 완료되면 LUV가 포함된 분획들을 합쳐 4 °C 암소에 보관합니다. 약 2 ml의 ~ 2 mM 지질이 정제됩니다 (Figure 1D).
5. LUV를 이용한 BCL-2 패밀리 연구
- BCL-2 단백질이 LUV 투과화를 직접적으로 유도하는 능력과 투과화 활성의 조절 여부를 테스트합니다. LUV 분석은 일반적으로 37 °C에서 100 μl 부피로 수행하며, 30 - 60분 후의 단일 시점(그림 2A-C, 3A-B)으로 분석하거나, 최대 1시간 동안 1 - 2분 간격으로 키네틱 연구(그림 2D)를 통해 분석할 수 있습니다. 구성 성분, 스톡/최종 농도 및 첨가 순서를 설명하는 대표적인 분석 설계가 제공됩니다(표 1). 또한, 각 측정 전에 마이크로플레이트 리더가 플레이트를 가볍게 흔들도록 설정하는 것이 권장됩니다. 처음 몇 분 동안은 (온도 변화, 혼합 등으로 인해) 불규칙한 측정값이 나타나는 경우가 많으므로, 일반적으로 키네틱 연구에서는 2 - 3회 측정 이후의 데이터 포인트를 고려합니다. 또한 LUV 배치의 가변성과 활성화 또는 억제 임계 농도에서의 단백질 상호작용 효율성으로 인해 일부 조건에서 오차 막대가 크게 생성되는 경우가 흔히 발생합니다.
- BCL-2 가족 단백질 스톡은 LUV 버퍼에 100x 농도로 희석해야 하며, BID가 없을 때 최소한의 BAX 의존적 LUV 투과화를 검출하는 데 필요한 최저 농도와 BAX 및 BID 사이의 유의미한 시너지 효과를 찾는 위해 BAX, BID 및 기타 모든 단백질의 필요한 적정(titration)을 수행합니다. 또한, 단백질 낭비를 줄이고 후속 단백질 첨가 농도를 최소화하기 위해 다른 모든 단백질에 대해서도 적정이 필요합니다.
6. 대표 결과
BCL-2 가족 의존적 LUV 투과성 조절을 관찰하고 조사하기 위한 다양한 방법이 있습니다. LUV 투과성 양성 대조군을 생성하기 위해, 세제-활성화 BAX12를 사용합니다. 세제인 n-octyl-β-D-glucoside (OG)는 BAX 활성화를 인위적으로 유도하며 (2.3 μM OG-BAX 100 μl 제조법: LUV 완충액 내 5 μg BAX + 0.7% OG, 4 °C에서 60분 동안 배양 후 소분하여 -80 °C에 보관), 따라서 OG-BAX (10 - 100 nM)를 신뢰할 수 있는 양성 대조군으로 사용할 수 있습니다. 특히 0.025% 미만의 OG 농도는 LUV 투과성에 직접적인 영향을 주지 않습니다. 분석당 LUV 형광의 최대량을 결정하기 위해 0.5% CHAPS 처리를 사용하며, 이 값을 100% 기준으로 설정합니다. 모든 처리는 3반복으로 설정해야 합니다. LUV 대조군 분석 설정의 예시는 Table 1에 나와 있으며, 해당 데이터는 Figure 2A에 제시되어 있습니다.
BCL-2 가족 단백질을 이용한 LUV 투과성을 연구하기 위해 반드시 선행되어야 할 단계는 최적의 방출을 촉진하는 BAX 및 BID의 농도를 설정하는 것입니다. 개별 단백질 표본마다 배경 투과 활성이 다르게 나타나므로, 보다 정밀한 분석을 설정하기 전에 적정 과정을 거치는 것이 권장됩니다. BAX(50 - 200 nM)와 BID(0 - 10 nM)를 적정하여 최소한의 배경 방출과 최적의 시너지 효과를 확인해야 하며, 이는 다음에서 보여주는 바와 같습니다. 그림 2B-C각각입니다. 다양한 형태의 BID 단백질은 R에서 구매할 수 있습니다.&D Systems에서 구입할 수 있으며, 또는 BID BH3 도메인 펩타이드를 Anaspec에서 구입할 수 있습니다. LUV 분석에 적합한 상용 BAX 형태는 없으므로, 기발표된 방법을 사용하여 발현 및 정제해야 합니다.3,13.
BAX와 BID의 농도 및 시너지 효과가 확립되면, 일반적인 분석 방법은 BAX 및 BID 의존적 LUV 투과성에 항-apoptosis 단백질이 미치는 영향을 결정하는 것입니다. BCL-xL은 상업적으로 이용 가능한 항-apoptosis BCL-2 구성원으로, 보통 BAX 또는 BID 대비 5 - 10배의 몰 과량 범위에서 BAX와 BID의 활성을 농도 의존적으로 억제합니다(그림 3A). 이러한 억제 효과는 이후 BH3-only 단백질(BCL-xL 대비 2 - 5배 몰 과량) 또는 BH3 도메인 펩타이드(BCL-xL 대비 5 - 10배 몰 과량)를 추가함으로써 되돌릴 수 있으며, 이들은 BCL-xL에 결합하여 BAX와 BID가 시너지 효과를 내어 LUV를 투과시킬 수 있게 합니다(그림 3B). 그림 3B에서는 전체 길이의 재조합 인간 PUMAβ의 효과를 보여주며, PUMA BH3 도메인 펩타이드 또한 기능적으로 유사합니다(데이터 미제시)8. PUMA 단백질이 BAX와 BID에 대한 BCL-xL의 억제 효과를 해제하므로, 이 실험은 일반적으로 '탈억제 분석(de-repression assay)'이라고 합니다. 이상적으로는, 탈억제를 유도하는 BH3-only 단백질/펩타이드의 추가가 BAX 활성화에 미치는 영향이 최소화되어야 합니다14.
그림 1. (A) 클로로포름으로 용해시킨 지질들을 혼합하고 건조하여 지질 필름을 형성한 후 캡을 씌웁니다. (B) ANTS 및 DPX 용액을 준비하고 혼합한 다음, 완전한 용해와 균질화를 위해 초음파 처리합니다. 이 용액을 지질 필름에 첨가하고 바이알을 파라필름으로 밀봉한 후, 워터 배스에서 5 min 동안 초음파 처리합니다. 이제 용액은 우윳빛으로 보일 것입니다. (C) 초음파 처리된 지질 용액을 미니 압출기에 넣고 31회 처리한 후, 이후 정제를 위해 준비된 Sepharose S-500 컬럼에 첨가합니다. (D) 크기 배제 크로마토그래피 후 얻은 분획들은 LUV 버퍼와 LUV 버퍼 + 0.5% CHAPS에서의 상대 형광 단위(RFUs)를 비교하여 분석합니다. "LUV 버퍼" 측정값은 온전한 LUV가 있는 상태의 배경 형광을 나타내며, "LUV 버퍼 + 0.5% CHAPS" 조건은 LUV의 존재를 나타내는 용해 유도 형광 증가를 보여줄 것입니다. 일반적으로 분획 3과 4에 LUV가 포함되어 있으며, 분석 후 이를 혼합합니다. 분획 5와 6에는 압출 후 LUV 내부에 포함되지 않은 ANTS(즉, LUV 외부에 존재하는 ANTS)가 포함되어 있으며, 이는 CHAPS와 무관하게 높은 형광을 나타냅니다. 여기를 클릭하여 더 큰 그림 보기.
그림 2. LUV를 이용한 BCL-2 family 대조 실험 및 BAX/BID 적정. (A) 대조 실험. LUV를 LUV 버퍼 단독, 0.025% octylglucoside "OG", 50 nM BAX 또는 50 nM OG-BAX로 처리했다. LUV를 37 °C에서 60분 동안 배양했다. 투과율(%)은 모든 샘플에서 버퍼 처리군의 형광 값을 빼서 결정하며, 100% 투과율은 0.5% CHAPS로 가용화된 샘플로 결정한다. 실험값을 CHAPS 값으로 나누어 LUV 투과율(%)을 구한다. OG-BAX는 계면활성제로 활성화된 BAX이며, LUV 투과성의 신뢰할 수 있는 양성 대조군이다. (B) 최적 BAX 농도 결정. LUV를 10 nM C8-BID "BID" 존재 하에 증가하는 농도의 BAX (50 - 200 nM) 또는 버퍼 단독으로 처리했다. (C) 최적 BID 농도 결정. LUV를 100 nM BAX 존재 하에 증가하는 농도의 BID (0 - 10 nM)로 처리했다. (D) LUV 투과성 동역학 데이터셋의 예시. LUV를 BAX (100 nM) ± BID (10 nM)로 처리했다. 각 측정 전 2초 동안 플레이트를 가볍게 흔들어준 후, 30분 동안 2분마다 측정을 수행했다. 처음 세 번의 측정값 (0, 2, & 4분)은 그래프에 포함되지 않았다. 최소 및 최대 상대 형광 단위(RFU)는 섹션 4.3에 설명된 대로 결정했다. 그림 2A-C의 오차 막대는 3회 반복 측정 데이터의 표준 편차를 나타낸다. 2D의 데이터는 2회 반복 측정한 결과이다.
그림 3. LUV를 사용하여 탐구한 일반적인 BCL-2 가족 상호작용의 예시. (A) BAX 및 BID에 의해 매개되는 LUV 투과성이 BCL-xL에 의해 억제된다. LUV를 100 nM BAX, 10 nM BID 및 점증 농도의 BCL-xL (0 - 500 nM)과 함께 배양하였다. LUV는 37 °C에서 60분 동안 배양되었다. (B) PUMA가 BCL-xL의 억제를 해제하여 BAX 및 BID의 기능을 촉진한다. LUV를 100 nM BAX, 10 nM BID, 500 nM BCL-xL 및 (0 - 2.5 μM) PUMA의 조합과 함께 37 °C에서 60분 동안 배양하였다. BAX 단독 처리 시에는 PUMA를 2.5 μM 농도로 사용하였다. 오차 막대는 3회 반복 측정 데이터의 표준 편차를 나타낸다.
| 첨가 순서: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| 조건 | LUV 완충액 | OG (0.7%) | BAX (2.3 μM) | OG-BAX (2.3 μM) | CHAPS (10%) | LUVs (2 mM) | 합계 |
| 완충액 | 95 μl | 5 μl | 100 μl | ||||
| OG (0.015%) | 92.83 μl | 2.17 μl | 5 μl | 100 μl | |||
| BAX (50 nM) | 92.83 μl | - | 2.17 μl | 5 μl | 100 μl | ||
| OG-BAX (50 nM) | 92.83 μl | 2.17 μl | 5 μl | 100 μl | |||
| CHAPS (0.5%) | 90 μl | 5 μl | 5 μl | 100 μl |
표 1. LUV 투과성에 미치는 OG-BAX의 영향을 결정하기 위한 대조 분석 예시.
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토론
설명된 LUV 생성 방법은 OMM과 유사한 생화학적으로 정의된 막 환경에서 다양한 BCL-2 가족 단백질, 펩타이드 및 관련 시약의 기능을 테스트할 수 있는 신속하고 효율적인 수단을 제공합니다. LUV 투과성을 결정하기 위해 종점 값을 사용하는 경우, 여러 개의 플레이트를 설정하여 단 하루 만에 수백 가지 조건을 분석할 수 있습니다. 이러한 분석에서 제한 요인이 되는 시약은 주로 재조합 단백질의 품질과 양이므로, 단백질 정제에 충분한 시간과 자원을 투자해야 재현성 있는 LUV 분석 결과를 얻을 수 있습니다.
저희의 경험에 따르면, LUV를 4 °C 암소에 보관했을 때 일반적으로 최대 2주 동안 BAX 및 BID에 반응합니다. 그러나 재조합 BCL-2 단백질은 더 불안정하며 여러 차례의 냉동/해동 반복 후 활성이 현저하게 변화하기 쉽습니다. 따라서 단백질 스톡은 가능한 가장 높은 농도로 유지하며 -80 °C에서 소량으로 분주하여 보관하고, 사용 직전에 희석할 것을 권장합니다. 이...
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공개 사항
선언된 이해상충 없음.
감사의 글
동료애와 지지를 보내준 Chipuk 실험실의 모든 구성원에게 감사를 표합니다. 또한, 본 연구의 실험적 토대를 마련해 준 Tomomi Kuwana와 Donald Newmeyer에게 감사의 마음을 전합니다. 본 연구는 NIH CA157740 (J.E.C. 수혜) 및 NIH P20AA017067 (J.E.C. 수혜)의 파일럿 프로젝트 지원을 받아 수행되었습니다. 또한, 본 연구의 일부는 March of Dimes Foundation의 연구비 5-FY11-74 (J.E.C. 수혜)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosph–thanolamine "PE" | Avanti | 850725C | |
| L-α-Phosphatidylcholine (닭 알) "PC" | Avanti | 840051C | |
| L-α-Phosphatidylinositol (소 간) "PI" | Avanti | 840042C | |
| L-α-Phosphatidylserine (돼지 뇌) "PS" | Avanti | 8400320 | |
| Cardiolipin (소 심장 - 나트륨염) "CL" | Avanti | 840012C | |
| 미니 압출기 세트 | Avanti | 610023 | |
| PC 멤브레인 0.2 mM | Avanti | 610006 | |
| Costar 블랙 96웰 플레이트 | Fisher Scientific | 07-200-590 | |
| Caspase-8 절단 인간 BID | R&D Systems | 882-B8-050 | |
| 인간 BCL-xL (C-말단 제외) | R&D Systems | 894-BX-050 | |
| BID/PUMA BH3 도메인 펩타이드 | Anaspec | 61711/62404 | |
| Synergy H1 하이브리드 멀티모드 마이크로플레이트 리더 | BioTek | None |
참고문헌
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- Kuwana, T. lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane. Cell. 111, 331-342 (2002).
- Lovell, J. F. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
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재인쇄 및 허가
