Method Article

형광 현미경으로 여러 세대 이상 라이브 포유류의 세포에 플라스미드 복제 모니터링

DOI:

10.3791/4305

⸱

December 13th, 2012

 ,  , 
1Department of Oncology, University of Wisconsin - Madison

In This Article

Summary

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라이브 셀에서 개별 DNA 분자를 관찰하는 방법이 설명되어 있습니다. 기술은 관심의 DNA에 설계 구속력이 사이트에 휘황 태그 LAC 억제 단백질의 바인딩에 기반을두고 있습니다. 이 방법은 시간이 지남에 라이브 세포에서 많은 재조합 DNAs를 수행하도록 구성 할 수 있습니다.

Abstract

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몇 자연스럽게 - 발생 plasmids은 포유류의 세포에 보관됩니다. 이 중 여러 사람이 malignancies 1-3의 원인 엡스타인 - 바 바이러스 (EBV)와 Kaposi 육종 - 관련 herpesvirus (KSHV)를 포함 감마 herpesviruses의 genomes이 있습니다. 이 두 genomes들은 부족 전통 centromeres 4-8에도 불구하고 라이센스 방식으로, 하나의 바이러스 단백질과 세포의 복제 기계를 사용하여 각 복제하고 있으며, 세포 분열 동안 딸 세포에 전달됩니다.

많은 작품은 그러한 남부 blotting 및 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광과 같은 방법을 사용하여 이러한 플라스미드 genomes의 복제를 특징 완료되었습니다. 이러한 방법은하지만 제한됩니다. 양적 PCR 및 남부 blots은 세포의 인구 세포 당 plasmids의 평균 개수에 대한 정보를 제공합니다. 물고기는 평균 수와 플라스미드의 배포를 모두 보여 단일 셀 분석입니다 하지만 세포 인구의 당 세포 검사 셀의 부모 나 자손에 대한 정보를 허용하지 정적입니다.

여기, 우리는 라이브 셀의 plasmids를 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 관심을 9 플라스미드의 여러 사이트에 휘황 태그 유당 억제 단백질의 바인딩에 기반을두고 있습니다. 관심 DNA는 유당 연산자 (LacO) 시퀀스의 약 250 탠덤 반복을 포함 할 수 있도록 설계되어 있습니다. LacO은 특히 형광 단백질에 융합 할 수있는 유당 억제 단백질 (LacI)에 의해 구속된다. 융합 단백질은 하나 엔지니어링 플라스미드 또는 retroviral 벡터에 의해 도입에서 표현 할 수 있습니다. 이러한 방법으로, DNA 분자는 휘황 태그하므로 형광 현미경을 통해 볼 수가 있습니다. plasmids이 볼 수 할 준비가 될 때까지 융합 단백질은 IPTG의 존재의 배양 세포에 의해 플라스미드 DNA를 바인딩에서 차단됩니다. ontent는 ">이 시스템은 plasmids은 여러 세대에 걸쳐 세포를 생활의 합성의 속성을 드러내고과 딸 세포에 파티션에서 모니터 할 수 있습니다. 이상적인 세포가 자기편 있으며, 쉽게 transfected, 대형 핵을 갖추고 있습니다.이 기술은 결정하는 데 사용 된 것으로 EBV-파생 plasmids의 84 %가 각 세대를 합성하고 새로 합성 plasmids 파티션의 88 %가 충실하게 헬러 셀의 딸 세포에.이 EBV의 plasmids의 페어가에서 자신의 합성 이후에 묶여 또는 자매 chromatids와 관련된 것으로 볼 수 있었다 S- 그들이 Anaphase 10 구분 자매 chromatids로 분리 볼 때까지 단계가. 방법은 현재 헬러 셀 및 SLK 세포에서 KSHV의 genomes의 복제를 연구하는 데 사용하고 있습니다. 헬러 세포는 인간의 상피 세포를 불후의하고 있으며, SLK 셀이 남을 아르 내피 인간 세포. SLK 세포가 원래 KSHV의 병변에서 파생 된 있지만, 헬러이나 SLK 셀 라인도 자연스럽게 harbors KSHV의 genomes 11. 바이러스 복제를 공부하는 것 외에도,이 시각화 기술은 또한, 제거, 또는 합성, 현지화 및 기타 재조합 플라스미드 DNAs의 파티션에 대한 다양한 DNA 시퀀스 요소의 돌연변이의 효과를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

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1. 공개 Plasmids있는 세포 공학

  1. 시각화 할 플라스미드에 유당 운영자 순서 (LacO)의 약 250 사본을 포함하는 DNA 조각을 소개 표준 제한 소화 또는 동종 재조합 기술을 사용합니다. 우리 플라스미드는 약 170 kbp의 BACmid이고 Kaposi 육종 - 관련 헤르페스 바이러스의 전체 게놈 (KSHV)와 hygromycin 12 인코딩 저항이 포함되어 있습니다.
  2. 소개 LacO을 포함 Lipofectamine 2000 transfection하여 포유류의 세포에 플라스미드 DNA합니다. 우리는 25 μl Lipofectamine 2000, 0.5 ML OptiMEM, 및 3.5 ML DMEM으로 플라스미드 DNA를 정제 10 μg을 4 시간에 60mm 요리 헬러와 SLK 세포를 transfected.
  3. 48 시간 10 % 태아 소 혈청 및 배양 세포 5 개 ML DMEM으로 문화 매체를 변경합니다.
  4. 소개 찮아에 대한 항생제 선택을 포함하는 중간에 대형 요리와 문화 세포에서 낮은 밀도의 플레이트 세포smid, 우리는 300 μg / 3 주 ML의 hygromycin과 10% 태아 소 혈청과 DMEM에서 셀을 선택했습니다.
  5. 새로운 문화 요리에 hygromycin 방지 식민지....

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Results

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대표 실험에서 얻은 Z-스택의 최대 강도 계획은 그림 3에 표시됩니다. 일반적인 플라스미드 신호들은 단일 또는 plasmids의 클러스터 대표 여부에 따라 Z-스택의 3-8 조각,에 존재한다. 셀 유사 분열에 도달 할 때까지 EBV 및 KSHV 파생 plasmids의 경우, 신호가 세포 내에서 천천히 이동합니다. 세포 자체가 실험의 과정을 통해 마이그레이션. 또한 구형이되고 유사 분열 동안 음식에서 분리. 건강 헬러와 SLK 세포에 대한 세포주기는 약 24 시간 정도 소요되며 세포주기를 완료하는 데 30 개 이상의 시간을 이러한 유형의 세포가 건강에 해로운 것으로 간주되어야한다. 딸 세포는 일반적으로 서로 가까이에 첨부하고 다음 세포주기에서 동시에 분할로 이동하십시오. 세포주기를 완료하려면 표시 할 수 있습니다 만 셀은 분석해야합니다.

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Discussion

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여기에 설명 된 방법은 여러 세대에 걸쳐 시간이 지남에 따라 실시간으로 포유류의 세포에 plasmids를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 여기 빛에 노출을 제한함으로써, 우리는 최소 72 시간, 3 셀 부문을 대표하는 16-32 세포의 콜로니를 통해 새로 분할 쌍의 세포를 수행하는 이러한 기술을 사용했습니다. 이 실험은 정량 PCR, blotting 남부 및 어류와 같은 정적 assays에서 얻을 수없는 정보를 제공합니다.

예를 직렬 LacO 반복과 같은 반복적 인 시퀀스와 plasmids를 사용하는 경우 rearrangements가 발생할 수 있으므로 그것은 동질적인 구조 plasmids에 대한 세포의 클론을 상영하는 것이 필수적입니다. 또한, 최적의 신호 강도에 대한 레트로 바이러스 감염과 감염된 세포의 화면 클론을 최적화하기 위해 유용합니다. 너무 많은 LacI 단백질을 표현 세포는 핵에 높은 배경 형광을 가지게 될 것이며, 너무 작은 표현들이 약 신호를해야합니다. 마.......

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Disclosures

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgements

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이 작품은 NIH와 ACS, T32CA009135 포함 CA133027, CA070723 및 CA022443에서 교부금의 지원을받는되었다. 빌 Sugden은 미국 암 협회 연구 교수입니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트
DMEM GIBCO 11,965
OptiMEM GIBCO 31,985
태아 소 혈청 Hyclone SH30910.03
페니실린 시그마 P3032
스트렙토 마이신 황산 시그마 S9137
Hygromycin Calbiochem 400050 SLK 400 μg / ML, 300 μg / 헬러에 ML
이소 프로필 - BD-thiogalactoside (IPTG) 로슈 10 724 815 001 최종 농도 200 μg / ML
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
HEPES GIBCO 15,630
유리 바닥 요리 MatTek P35G - 1.5-10-C
CultFoil Pecon 000000-1116-08
Axiovert 200M Zeiss
Colibri Zeiss 423052-9500-000
중립 백색 LED Zeiss 423052-9120-000
필터 큐브 75 HE Zeiss 489075-0000-000
계획 - 고차 색지움의 63x/1.4 목표 Zeiss 440762-9904-000
CascadeII : 1024 EMCCD 카메라 Photometrics B10C892007
Tempcontrol 미니 Zeiss / Pecon 000000-1116-070
Tempcontrol 37-2 디지털 Zeiss / Pecon 000000-1052-320
CTI 컨트롤러 3700 디지털 Zeiss / Pecon 411856-9903
목표 히터 Zeiss / Pecon 440760-0000-000
무대 난방 삽입 P Zeiss / Pecon 411861-9901-000
무대 위로 보육 S Zeiss / Pecon 411860-9902-000
가습기 시스템 Zeiss / Pecon 000000-1116-065

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
  2. Chang, Y., et al.

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