는 여기에 설명 생체 내 기술. 이 방법은 간단하고 실험 매개 변수 및 모델 시스템의 다양한 맞게 할 수있을만큼 유연하다.
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이 논문에서
요약
초록
Caenorhabdits elegans는 성인과 배아 단계의 투명성에 의해뿐만 아니라 융합 단백질 1-4의 무수한을 표현 유전자 돌연변이 유전자 변형 종자의 가용성에 의해 촉진되어 스트레스 저항의 연구에서 널리 사용되었습니다. 또한, 이러한 세포 분열과 같은 동적 프로세스는 휘황 표시 기자 단백질을 사용하여 볼 수 있습니다. 유사 분열의 연구가 손상 생물 등 다양한 시스템에서 시간 경과 실험의 사용을 통해 촉진 될 수있다; 따라서 초기 C. elegans의 배아가 잘 본 연구에 적합합니다. 고성능 현미경에 설치를 통해 간단한 가스의 흐름을 이용하여 스트레스가 가능합니다, 여기에 제시된 것은 anoxic에 대한 응답 (<2 ppm으로 O 2 99.999 % N 2) 하위 세포 구조를 생체 이미징에있는이 기술입니다. microincubation 챔버는을 통해 질소 가스 흐름과 회전 디스크 공 촛점 현미경과 함께 사용됩니다동물 생체에 이미징 할 수있는 통제 된 환경을 만들 수 있습니다. 사용 GFP를 태그 감마 tubulin과 히스톤은 역학과 세포 분열의 체포는 동안과 산소 박탈 환경에 노출 후, 전에 모니터 할 수 있습니다. 이 기법의 결과는 산소가 결핍되어서에 노출 배아의 blastomeres에서 높은 해상도, 자세한 동영상 및 세포 구조의 이미지입니다.
프로토콜
1. 샘플 준비
- 해당 유전자 변형 C.를 생성하거나 획득 elegans는 유전자 변형 방법을 사용하여 관심이나 Caenorhabditis 유전학 증권 센터 (CGC) 또는 동료의 변형. 세포 분열에 대한 마커로 염색체와 중심체를 시각적으로 5,이 경우에서 우리는 (파이-1 :: GFP :: H2B 파이-1 :: tbg-1 :: GFP) 부담 TH32를 사용하고 있습니다.
- 세 가지 방법 중 하나를 사용하여 동기화 된 인구를 생성 : 1) 차아 염소산염 솔루션의 gravid 성인 분해 및 시드 판에 gravid 성인을 선택하고 1-2 시간에 배아를 덮어두고 나머지 배아에게 6 2)를 사용하거나, 3) L4를 선택 새로운 시드 판에 혼합 인구 이동의 애벌레.
- 20 nematodes를 성장 ° C L1의 유충 또는 24 시간 후 L4의 털을 갈다에서 부화에서 72 시간을 약 96 시간를 취할 것입니다 gravid 젊은 성인에. 자궁에서 태아 (2-20 셀) imag에 대한 최적의 크고 blastomeres와 핵을 포함ING 하위 세포와 하위 핵 변화, 각각. 이 방법론은 초기 배아의 풍부한 숫자를 포함 젊은 ....
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결과
심각한 산소가 결핍되어서 (산소 결핍)에 노출 C. elegans의 배아는 개발 및 세포 분열 7 등의 생물학적 과정을 체포하여 생존 할 수 있습니다. 세포 분열의 산소 결핍 유발 체포 동물 생체에 이미징 할 수있는 통제 된 환경을 만들을 통해 질소 가스 흐름과 회전 디스크 공 촛점 현미경과 함께 microincubation 챔버를 사용하여, 하위 세포 수준에서 모니터 할 수 (그림 1). 관심 세포 구조는 다양한 가스 환경에 노출 배아에서 모니터링 할 수 있으며이 경우에는 우리는 산소 결핍에 노출 배아의 염색체 구조를 모니터링 할 수 GFP 태그 감마 tubulin과 히스톤 H2B를 사용했습니다.
산소 결핍에 노출 배아 내에서 prophase blastomeres의 염색체는 압축되고 내부 핵 주변으로 정렬, 현상은 "염색체 도킹"(그림 2, 영화 1)이라고도합니.......
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토론
산소가 결핍되어서 및 일시 중지 애니메이션
심각한 산소가 결핍되어서에 노출 어떤 생물에 치명적일 수 있지만, 일부 생물은 산소 결핍에 노출 생존 할 수 있습니다. C.의 경우 elegans는 산소 결핍 노출의 생존은 발달 단계 및 산소 결핍에 대한 응답에 따라 달라집니다 항목은 관찰 할 수있는 생물학적 과정의 번호가 체포되는 정지 애니메이션의 치료 상태로 있습니다. 산소 환경 7,9에 다시 제출 될 때까지 세포 분열, 개발, 운동, 식사, 생식 과정은 중단. 산소 결핍 노출 배아의 세포주기의 진행, 계면에서 가역적으로 체포, 늦은 prophase 또는 metaphase. 이러한 고정 샘플과 산소 박탈 환경에서 특정 하위 세포 구조를 이미징 할 수 있습니다 생체 GFP 융합 단백질 assays에 immunostaining와 같은 세포 생물학 기술의 사용은, 식별 및 특성화에 역할을되었습니다C........
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
우리는 입력 및 빠 디야 연구소 회원의 의견을 우리의 감사를 전달하고 싶습니다. 이 작품에서 선충류의 긴장은 연구 자원에 대한 NIH 국립 센터 (NCRR)의 지원을 받고 있습니다 Caenorhabditis 유전학 센터에 의해 제공되었다. 우리는 공 촛점 현미경과 기술 지원을 위해 박사 론 턴벌을 인정하고 감사합니다. 이 작품은 PAP에 대한 국립 과학 재단 (NSF-IOS, 직업)에서 교부금에 의해 지원되었습니다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 / 장비 | 구성 | ||
| 차아 염소산염 솔루션 | 0.7 g 코, 12 ML 5 % NaOCl은 ddH 2 0과 50 ML에 가져 | ||
| M9 버퍼 | 3g KH 2 PO 4, 11g 오세영 2 HPO 4, 5g NaCl, 1 L ddH 2 O 당 1 ML (1 M) MgSO 4 | ||
| 유리 현미경 슬라이드 | 피셔 과학 | 12-550-343 | 3 "개"x1.0의 mm |
| 라운드 마이크로 coverglass | 전자 현미경 과학 | 72223-01 | 25mm의 직경 |
| 할로 카본 오일 700 | 시그마 | H8898-100ml | |
| 마취제 | 0.5 % tricaine, 0.05 % tetramisole | ||
| 라이덴 휴일 재관류 Microincubator | 하버드 장치 | 650041 | |
| UHP 질소 | Calgaz (에어 Liquide) | > 99.9990 % N 2 <2 ppm으로 O 2 | |
| 플라스틱 튜브 | VWR | 89068-468 | 0.062 "ID X 0.125"OD |
| 디스크 공 촛점 현미경을 스피닝 | McBain 시스템 | Zeiss 광학 현미경, epifluorescence 조명 시스템, CSU-10 요코 공 촛점 스캐너, 하마 마츠 전자 배율 CCD 카메라를 거꾸로. |
참고문헌
- Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
- Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11<....
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재인쇄 및 허가
