방법 논문

에 산소 결핍 유도 일시 중지 된 애니메이션을 시각화하기 위해 시간 경과에 현미경을 사용

DOI:

10.3791/4319

⸱

2012년 12월 3일

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of North Texas

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

는 여기에 설명 생체 내 기술. 이 방법은 간단하고 실험 매개 변수 및 모델 시스템의 다양한 맞게 할 수있을만큼 유연하다.

초록

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Caenorhabdits elegans는 성인과 배아 단계의 투명성에 의해뿐만 아니라 융합 단백질 1-4의 무수한을 표현 유전자 돌연변이 유전자 변형 종자의 가용성에 의해 촉진되어 스트레스 저항의 연구에서 널리 사용되었습니다. 또한, 이러한 세포 분열과 같은 동적 프로세스는 휘황 표시 기자 단백질을 사용하여 볼 수 있습니다. 유사 분열의 연구가 손상 생물 등 다양한 시스템에서 시간 경과 실험의 사용을 통해 촉진 될 수있다; 따라서 초기 C. elegans의 배아가 잘 본 연구에 적합합니다. 고성능 현미경에 설치를 통해 간단한 가스의 흐름을 이용하여 스트레스가 가능합니다, 여기에 제시된 것은 anoxic에 대한 응답 (<2 ppm으로 O 2 99.999 % N 2) 하위 세포 구조를 생체 이미징에있는이 기술입니다. microincubation 챔버는을 통해 질소 가스 흐름과 회전 디스크 공 촛점 현미경과 함께 사용됩니다동물 생체에 이미징 할 수있는 통제 된 환경을 만들 수 있습니다. 사용 GFP를 태그 감마 tubulin과 히스톤은 역학과 세포 분열의 체포는 동안과 산소 박탈 환경에 노출 후, 전에 모니터 할 수 있습니다. 이 기법의 결과는 산소가 결핍되어서에 노출 배아의 blastomeres에서 높은 해상도, 자세한 동영상 및 세포 구조의 이미지입니다.

프로토콜

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1. 샘플 준비

  1. 해당 유전자 변형 C.를 생성하거나 획득 elegans는 유전자 변형 방법을 사용하여 관심이나 Caenorhabditis 유전학 증권 센터 (CGC) 또는 동료의 변형. 세포 분열에 대한 마커로 염색체와 중심체를 시각적으로 5,이 경우에서 우리는 (파이-1 :: GFP :: H2B 파이-1 :: tbg-1 :: GFP) 부담 TH32를 사용하고 있습니다.
  2. 세 가지 방법 중 하나를 사용하여 동기화 된 인구를 생성 : 1) 차아 염소산염 솔루션의 gravid 성인 분해 및 시드 판에 gravid 성인을 선택하고 1-2 시간에 배아를 덮어두고 나머지 배아에게 6 2)를 사용하거나, 3) L4를 선택 새로운 시드 판에 혼합 인구 이동의 애벌레.
  3. 20 nematodes를 성장 ° C L1의 유충 또는 24 시간 후 L4의 털을 갈다에서 부화에서 72 시간을 약 96 시간를 취할 것입니다 gravid 젊은 성인에. 자궁에서 태아 (2-20 셀) imag에 대한 최적의 크고 blastomeres와 핵을 포함ING 하위 세포와 하위 핵 변화, 각각. 이 방법론은 초기 배아의 풍부한 숫자를 포함 젊은 성인의 인구를 생성 할 수있는 방법을 제공합니다.

2. 슬라이드 준비 및 산소 결핍 상공 회의소는 설정

  1. 충분한 크기의 뚜껑으로 덮여 큰 페트리 접시 또는 빈 내부에 습기가 종이 타월을 배치하여 준비된 슬라이드를 개최 할 수있는 습윤 챔버를 확인합니다.
  2. 전자 레인지 나 물 목욕을 통해 유리의 혼합물을 가열하여 deionized H 2 O에서 용융 2퍼센트 아가로 오스를 준비합니다.
  3. 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 따뜻한 아가로 오스 1-3 방울을 넣으십시오. 바로 아가로 오스 드롭 (들)의 상단에 수직 반전 두 번째 슬라이드를 배치, 결과 패드가 얇고 기포 무료로 될 것이라고 약간 있도록 키를 누릅니다.
  4. 시원하고 천천히 슬라이드 중 하나에 아가로 오스 패드를 그대로두고 두 현미경 슬라이드를 갈라 놓을로 시간을 허용합니다. 이 아가로 오스 패드 interfe하지 할 수있을만큼 얇고을 보장하는 것이 중요합니다나중에 현미경 초점을 맞출 수있는 능력을 다시. 샘플을 시각화하는 능력은 현미경 사이에 다를 수 있습니다 사용 목적의 특정 광학 거리,에 따라 달라집니다.
  5. 작은 광장으로 아가로 오스 패드를 형성하기 위해 깨끗한 면도날을 사용합니다. 사용할 준비가 될 때까지 준비한 습기 챔버에 저장합니다.
  6. 주의 깊게 같은 깨끗한 면도날 사용하여 아가로 오스 패드의 가장자리를 타고 원형 25mm 마이크로 coverglass로 슬라이드에서 전송, 패드 아래에 기포의 축적을 피하고. 사용하도록 선택 둥근 coverglass은 microincubator에 적절하게 맞출 수 있습니다.
  7. 마취 용으로 사용 아가로 오스 패드로 마취 (0.5 % tricaine, M9 버퍼에 0.05 % tetramisole)의 방울을 추가합니다. 마취의 드롭에 5-10 웜 및 장소를 선택합니다. 운동을 중단 할 수 웜에 대해 1-3 분 소요됩니다.
  8. , 성인 자궁 내에서 태아를 관찰하는 대신 해부하는 배아의에 대한 근거는 배아 desicca의 가능성을 최소화하는 것입니다기 및 배아에서 질소 가스의 흐름에 따라 이동.
  9. 즉시 가스 챔버를 통해 흘러되기 때문에 탈수에서 웜을 방지하기 위해 웜의 상단에 할로 카본 오일 한 방울을 추가합니다. 할로 카본 오일은 점성 때문에 하나는 웜에 오일 앤 드롭를 수집하는 선택 웜의 pipet 팁 또는 팁을 사용할 수 있습니다.
  10. 웜을 포함하는 원형 coverglass가 준비되면, 라이덴의 두 절반은 microincubator이 분리되어 재관류를 폐쇄하고, coverglass는 조심스럽게 아래쪽 링에 수직으로 배치합니다. 챔버의 양면 그런 다음 긴밀하게 함께 종료되었습니다.
  11. 챔버 그런 다음 유연한 플라스틱 튜브를 통해 질소 가스 탱크에 연결 현미경 단계 (그림 1C)에서 원하는 지점에 위치합니다. 이 때 튜브와 microincubator는 조심스럽게 튜브와 챔버의 측면을 따라 포트 플러그의 안전한 첨부 파일을 확보하여 누수를 확인한다. 하나는 알 수그렇게 쉽게 누설가있는 경우 형성 거품,을 찾을 수있는 튜브 위에 비누 물을 소량의 확산.

3. 산소 결핍에 현미경

  1. 낮은 배율에서 동물을 찾은 다음, 이미지 조직 또는 성인 배아 blastomeres 또는 oocytes과 같은 관심 셀에 적절한 높은 배율 (이 응용 프로그램에 대한 64x)로 이동합니다. GFP 신호를 확인하고 관심있는 셀 (들)에 GFP 융합 단백질을 찾습니다 488 nm의 레이저를 사용합니다.
  2. 세포주기 체포의 특정 단계에서 체포을 시각화하기 위해 (예를 들면 말 prophase) 세포 분열의 이전 단계 (예 : 말 계면 또는 초기 prophase)에 blastomere를 확인합니다. 이러한 centriole 위치, 염색체 응축의 개시, 염색체 위치와 핵 봉투의 유무 등의 세포 마커는 세포주기 단계 (그림 2A)을 확인하는 데 도움이됩니다.
  3. 챔버 그런 다음 질소 가스 (99.999 %로 perfused 수 있습니다N 2, <2 ppm으로 O 2). 우리는 6 psi의 압력을 사용하여이 경우에, 그러나 압력은 조정 각 microincubator의 크기와 사용 튜브의 직경에 따라 최적화해야 할 수 있습니다. 질소는 필요에 따라 초점 평면을 조정, 방을 가득로 blastomere (들)을 모니터링하고 있습니다.
  4. 이 시점에서, 시간 경과 영상이 시작되었습니다. 영상은 내부 핵 막에 염색체의 경우 prophase의 체포와 도킹에 관심 현상을 캡처 할 수있는 한 필요에 따라에 진행됩니다. 이미지는 30 분 이상 더 이상마다 10 초에 한 번 촬영​​하고 있습니다. 이미지 캡처 및 이득과 레이저 전원과 같은 설정 주파수는 필요에 따라 조정해야합니다.
  5. 배아는 anoxic 환경에 대응하는 시간은 산소 결핍에 노출시 세포주기 단계에 따라 다를 수 있습니다. 일반적으로 산소 결핍 유도 prophase의 체포는 질소 가스의 흐름을 시작으로 20-30 분 이내에 발생합니다. 우리는 산소 결핍 유발 세포주기 체포 occu을 관찰 한<20 분에 rring. 이미지는이 기간 동안 얻을 수 또는 특정 이미지는 나중에 시간이 경과 시리즈에서 격리 할 수​​ 있습니다. 추가 옵션은 배아에서 하위 세포 구조를 시각화하는 비디오 현미경을 사용하는 것입니다.
  6. 산소 결핍 유도 체포 상태에서 복구를 문서화하려면, 가스는 꺼져 있고 챔버는 시간 경과 시리즈를 녹음하면서 확산에 의해 normoxia로 돌아갑니다 허용됩니다. 염색체의 세포주기의 진행과 undocking의 재개는 일반적으로 질소 가스를 사용하지 않도록 설정의 5-20 분 이내에 발생합니다.
  7. 별도의 실험에서 산소 결핍 표시기, resazurin가 흐름을 통해 microchamber에 배치 된 있습니다, 그것은 질소 가스의 흐름이 시작 후 챔버은 약 19 분의 평균 anoxic 될 것으로 판단되었다.
  8. 이미지와 동영상은 Imaris, 이미지 J 또는 포토샵을 사용하여 처리 및 표시를 위해 퀵타임으로 가져옵니다.

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결과

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심각한 산소가 결핍되어서 (산소 결핍)에 노출 C. elegans의 배아는 개발 및 세포 분열 7 등의 생물학적 과정을 체포하여 생존 할 수 있습니다. 세포 분열의 산소 결핍 유발 체포 동물 생체에 이미징 할 수있는 통제 된 환경을 만들을 통해 질소 가스 흐름과 회전 디스크 공 촛점 현미경과 함께 microincubation 챔버를 사용하여, 하위 세포 수준에서 모니터 할 수 (그림 1). 관심 세포 구조는 다양한 가스 환경에 노출 배아에서 모니터링 할 수 있으며이 경우에는 우리는 산소 결핍에 노출 배아의 염색체 구조를 모니터링 할 수 GFP 태그 감마 tubulin과 히스톤 H2B를 사용했습니다.

산소 결핍에 노출 배아 내에서 prophase blastomeres의 염색체는 압축되고 내부 핵 주변으로 정렬, 현상은 "염색체 도킹"(그림 2, 영화 1)이라고도합니...

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토론

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산소가 결핍되어서 및 일시 중지 애니메이션

심각한 산소가 결핍되어서에 노출 어떤 생물에 치명적일 수 있지만, 일부 생물은 산소 결핍에 노출 생존 할 수 있습니다. C.의 경우 elegans는 산소 결핍 노출의 생존은 발달 단계 및 산소 결핍에 대한 응답에 따라 달라집니다 항목은 관찰 할 수있는 생물학적 과정의 번호가 체포되는 정지 애니메이션의 치료 상태로 있습니다. 산소 환경 7,9에 다시 제출 될 때까지 세포 분열, 개발, 운동, 식사, 생식 과정은 중단. 산소 결핍 노출 배아의 세포주기의 진행, 계면에서 가역적으로 체포, 늦은 prophase 또는 metaphase. 이러한 고정 샘플과 산소 박탈 환경에서 특정 하위 세포 구조를 이미징 할 수 있습니다 생체 GFP 융합 단백질 assays에 immunostaining와 같은 세포 생물학 기술의 사용은, 식별 및 특성화에 역할을되었습니다C....

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공개 사항

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

감사의 글

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우리는 입력 및 빠 디야 연구소 회원의 의견을 우리의 감사를 전달하고 싶습니다. 이 작품에서 선충류의 긴장은 연구 자원에 대한 NIH 국립 센터 (NCRR)의 지원을 받고 있습니다 Caenorhabditis 유전학 센터에 의해 제공되었다. 우리는 공 촛점 현미경과 기술 지원을 위해 박사 론 턴벌을 인정하고 감사합니다. 이 작품은 PAP에 대한 국립 과학 재단 (NSF-IOS, 직업)에서 교부금에 의해 지원되었습니다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약 / 장비 구성
차아 염소산염 솔루션 0.7 g 코, 12 ML 5 % NaOCl은 ddH 2 0과 50 ML에 가져
M9 버퍼 3g KH 2 PO 4, 11g 오세영 2 HPO 4, 5g NaCl, 1 L ddH 2 O 당 1 ML (1 M) MgSO 4
유리 현미경 슬라이드 피셔 과학 12-550-343 3 "개"x1.0의 mm
라운드 마이크로 coverglass 전자 현미경 과학 72223-01 25mm의 직경
할로 카본 오일 700 시그마 H8898-100ml
마취제 0.5 % tricaine, 0.05 % tetramisole
라이덴 휴일 재관류 Microincubator 하버드 장치 650041
UHP 질소 Calgaz (에어 Liquide) > 99.9990 % N 2 <2 ppm으로 O 2
플라스틱 튜브 VWR 89068-468 0.062 "ID X 0.125"OD
디스크 공 촛점 현미경을 스피닝 McBain 시스템 Zeiss 광학 현미경, epifluorescence 조명 시스템, CSU-10 요코 공 촛점 스캐너, 하마 마츠 전자 배율 CCD 카메라를 거꾸로.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
  2. Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11, (2012).
  3. Hu, P. J. Dauer. WormBook. , 1-19 (2007).
  4. Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. Longevity and stress in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).
  5. Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations. Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).
  6. Sulston, J., Hodgkin, J. The Nematode Caenorhabditis elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
  7. Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).
  8. Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest. BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).
  9. Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, Anoxia. Padilla, P. A. , InTech. (2012).
  10. Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).
  11. Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
  12. Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. Breaking and making of the nuclear envelope. J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).
  13. Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
  14. Miller, D. L., Roth, M. B. C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause. Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).

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GFP

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