우리는 흐름 cytometric 부정적인 선택하여 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포 (AECII)의 급속한 절연을 설명합니다. 이 AECII 높은 생존 능력과 정결을 표시하고 면역 또는 전염성 질환과 같은 호흡기 질환에서의 역할에 대한 기능과 분자 연구 광범위한 적합합니다.
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이 논문에서
요약
초록
지난 수년 동안 폐의 면역 규제의 다양한 측면에 대한 폐포 타입 II 상피 세포 (AECII)의 후원금이 점차 인정 받고 있습니다. AECII는 염증 항공의 시토 킨 생산에 참여하고 감염 및 T-세포 매개 autoimmunity 1-8 모두에서 세포를 항원 제시로도 역할을 표시하고 있습니다. 따라서, 그들은 그러한에게기도 하이퍼 반응 등 임상 상황에서도 특별히 흥미있는 외국인뿐만 아니라 자기 항원 직접 또는 간접적 AECII을 타겟팅 감염. 그러나, 건강한 폐뿐만 아니라 염증의 폐포 타입 II 상피 세포에 의해 제공 자세한 immunologic 기능에 대한 우리의 이해는 단편 남아 있습니다. AECII 기능에 관한 많은 연구가 9-12 마우스 또는 인간의 폐포 상피 세포 라인을 사용하여 수행됩니다. 세포 라인과 함께 일하는 것은 확실히 같은 많은 수의 가용성 O와 같은 혜택을 제공합니다광범위한 분석을위한 F 세포. 그러나, 우리는 기본 손쥐 AECII의 사용이 감염이나 면역 염증과 같은 복잡한 과정이 세포 유형의 역할에 대한 이해를 갖게 될 것입니다. 기본 손쥐 AECII들은 분석 설정에서 역할을 모두 추가 외부 요인에 따라되었습니다 즉, 같은 호흡기 질환을 앓고있는 동물에서 직접 분리 할 수 있습니다. 예를 들어, 가능한 AECII은 intranasally 주로 복제 13이 세포를 대상으로 인플루엔자 바이러스에 감염된 생쥐에서 분리 할 수 있습니다. 중요한 것은, 건강한 쥐에서 분리 AECII의 전 생체 감염을 통해 감염에 장착 된 세포 반응의 연구는 더욱 확장 할 수 있습니다.
주요 손쥐 AECII의 절연에 대한 프로토콜은, CD11c, CD11b, F4/80에 대한 특정 항체로 인한 세포 현탁액의 라벨 다음에 마우스 폐의 효소 소화에 기초CD19, CD45 및 CD16/CD32. 세분화 된 AECII 그 다음 높은 라벨과 측면의 분산 (SSC 높은) 세포 인구로 식별되며 3 분류 형광 활성 세포로 구분됩니다.
마우스 폐에서 기본 상피 세포를 분리하는 다른 방법에 비해, 부정적인 선택에 의해 AECII의 흐름 cytometric 절연을위한 프로토콜은 비교적 짧은 시간에 손길이 닿지 않은, 매우 실용적 순수 AECII를 얻을. 또한, 및 패닝과 림프구의 고갈에 의한 절연이 기존의 방법과는 달리 항체 - 커플 링 자석 구슬 14, 15의 바인딩을 통해, 흐름 cytometric 셀 정렬은 셀 크기와 세분화에 의해 차별을 할 수 있습니다. 흐름 cytometric 셀 정렬을위한 장비를 사용할 수 있는지 감안할 때, 설명 절차는 상대적으로 낮은 비용으로 적용 할 수 있습니다. 표준 항체 및 폐 붕괴에 대한 효소 등 자기와 같은 별도의 시약 옆에구슬이 필요합니다. 절연 세포가 체외 문화와 T-세포 자극의 assays에서뿐만 아니라 transcriptome, 프로테옴 또는 secretome 분석 3, 4 등이 포함 기능 및 분자 연구, 다양한 적합합니다.
프로토콜
필요한 시약 및 재료에 관한 자세한 내용은 아래의 프로토콜의 끝 부분에 다음 표에 나열되어 있습니다. 작업을 시작하기 전에, 4 dispase의 ML과 ° C 물 목욕에 37 미리 따뜻하게을 포함하는 15 ML 튜브를 (마우스 하나씩)을 준비합니다. 가열 블록에서 곧 95-1% 낮은 용해 아가로 오스 (물)의 작은 aliquots를 가열 ° C 액화 때까지 사용 할 때까지 45 ° C에이어서 좋아.
1. 마우스 폐의 작성
- CO 2 질식하여 마우스를 희생. 참고 : 성공적으로 수행 될 수 없습니다와 같은 액체와 폐의 설치로, 프로토콜의 단계를 수행하므로이 기관을 손상하므로 자궁 경부 전위를 수행하지 마십시오. nociceptive 반사 손실을 보장합니다.
- 에탄올로 마우스를 뿌려서 몸의 복부 중간 선을 따라 긴 몫을합니다. 복부 털과 피부를 당겨하고 이후도 조심스럽게 잘라 복막을 제거합니다.
- 을 ...에게서 피를 뽑다왼쪽과 오른쪽 경정맥 정맥 (베나 jugularis)뿐만 아니라 신장 동맥 (Arteria renalis)를 절단하여 마우스. 조직과 흐르는 혈액을 제거합니다.
- 조심스럽게 다음 찔린하고 늑골을 멀리 절단하여....
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결과
건강한 쥐에서 분리 폐 세포 현탁액을 정렬하면 AECII 게이트는 일반적으로 42 정도 차지합니다 ± 모든 이벤트의 10 %입니다. 이 비율은 초기 세포 현탁액은기도에 채용 림프구와 기타 면역 세포의 상당히 높은 비율을 포함하므로, 이러한 바이러스 감염과 같은 호흡기 조건에 마우스를 사용하는 경우 현저하게 낮을 수 있습니다. 3 일 다음과 같은 감염에 IAV 감염된 폐 격리 AECII 위해 우리는 약 50 % AECII 게이트의 셀의 빈도의 감소를 관찰했습니다.
정렬 셀의 전형적인 종류뿐만 아니라 재 분석은 그림 1 B와 1 C로 그려져 있습니다. 표시된 바와 같이, 절연 세포의 순도는 약 92 계정 ± 5 %입니다. 그림 2A에서 우리는 순수한 세포 인구의 성공적인 분리에 의해 독점적으로 표현된다 계면 활성제 - 단백질 C,에 얼룩으로 확인 할 수 있습니다 보여AECII 16, 17.
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토론
유동 세포 계측법에 의한 손쥐 AECII의 절연에 대한 프로토콜은 기능과 분자 연구의 모든 범위의 마우스 폐에서 기본 셀을 액세스의 급속한 방법을 제공합니다. 설명 절차는 RNA 분리 (그림 2B 참조) transcriptome 연구로 직접 후속 분석을위한 번호 충분 AECII의 높은 가능한 순수 인구를 산출. 기능 어플리케이션의 경우, AECII 에어컨, 중간 또는 공동 문화 실험의 생성 예 수 있도록, 문화, 고립 된 세포를도 가능합니다. 특히 이러한 기능 연구에 대한 혜택으로 여기에 설명 된 바와 같이 부정적인 선택의 주요 세포의 분리는 항체 결합의 대상이 없었다 손길이 닿지 않은 세포를 얻을. 그러나, 세포 라인에서 수행 그 이상의 주요 AECII에서 연구의 장점에도 불구하고, 이러한 기본 세포의 사용에 실질적인 제한이 있습니다. 숫자의 단순한 제한 옆에, 광범위한 검사를 필요로하는 연구의 요구 사항을 충족하지 않을 수있는 기본 AECII는 우리가 48 시간 돌아 평균 관찰.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
우리는 바이오 안전성 수준이 샘플에서 기본 손쥐 AECII를 정렬에 기술 지원을위한 M. Höxter 감사드립니다.
이 작업은 DB에 독일 연구 재단 (DFG) (SFB587, TP B12 및 BR2221/1-1)와 하노버 바이오 메디컬 연구 학교 (DFG GSC 108)에서 AA에이고의 보조금에 의해 지원되었다. DB는 대통령의 이니셔티브 및 계약 번호 W2/W3-029에 따라 독일어 연구 센터의 Helmholtz 협회 (HGF)의 네트워킹 기금에서 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| 내주하시는 캐뉼라 Introcan 22G | 브라운 | REF 4252098B | |
| Dispase, 100 ML (5000 caseinolytic 단위) | BD Biosciences | 354235 | 15 ML 튜브 4 ML에 나누어지는, -20 ° C에서 저장 |
| Biozym 플라크 아가로 오스 | Biozym | 840101 | H 2 O 1 % W / V |
| 소 췌장, 2000 Kunitz 단위 / 유리 병에서 Deoxyribonuclease I | 시그마 - 알드리치 | D4263 | 갓 300 μl DMEM에 1 약병의 콘텐츠를 분해 |
| DMEM | Gibco | 22320-022 | 사용 등의 제조업체 (낮은 G에서 제공lucose, Pyruvate, HEPES) |
| 셀 스트레이너 (100 μm, 75 μm) | BD 팔콘 | 352360, 352350 | |
| 나일론 메쉬 (48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH의 | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
| CellTrics 50 μm 필터 | PARTEC | 04-0042-2317 | |
| 안티 - 마우스 CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | 클론 93, 정화 |
| 안티 - 마우스 F4/80 | BioLegend | 123116 | 클론 BM8, APC 결합 |
| 안티 - 마우스 CD11b | BioLegend | 101208 | 클론 M1/70, PE 결합 |
| 안티 - 마우스 CD11c | BioLegend | 117310 | 클론 N418, APC 결합 |
| 안티 - 마우스CD45 | BioLegend | 103102 | 클론 30 F11, 정화 |
| 안티 - 마우스 CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3, PE 결합 |
| polyclonal 염소 안티 쥐 IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE 결합 |
대체 fluorochromes에 커플 링 된 항체가 사용할 수있는 흐름 cytometer와 레이저에 따라 사용할 수 있습니다. |
참고문헌
- Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir. Res. 2, 33-46 (2001).
- Folkerts, G., Nijkamp, F. P. Airway epithelium: more than just a barrier. Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).
- Gereke, M., et al.<....
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재인쇄 및 허가
