Method Article

RNA-seq의 트롬빈 - 처리의 Transcriptomes 분석 및 제어 인간 폐 Microvascular 내피 세포

DOI:

10.3791/4393

⸱

February 13th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 다음과 같은 또는 트롬빈 치료없이 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 프로필 transcriptomes에 RNA-seq, 강력한 차세대 DNA 시퀀싱 기술을 적용 할 완전하고 자세한 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 다른 시약 또는 질병 상태에 의해 영향을 다양한 세포 나 조직에 generalizable 수 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mRNA 수준의 측정을 통해 세포의 유전자 발현의 특성은 세포의 전사 기계가 외부 신호 (예 : 약물 치료), 또는 어떻게 세포가 건강한 상태와 병에 걸린 상태 사이의 차이에 의해 영향을하는 방법을 결정하는 유용한 도구입니다. 차세대 DNA 시퀀싱 기술의 출현과 지속적인 개량을 통해 RNA-시퀀싱 (RNA-seq)는 성적 증명서의 모든 종류를 분류하기위한 모든 표현 유전자의 전사 구조를 파악하고 계량화 할 수 transcriptome 분석의 점점 인기있는 방법이되었다 주어진 셀, 조직 또는 유기체 1,2의 성적 증명서의 총 집합의 변화 표현 수준. RNA-seq은 점차 그 완전한 transcriptome를 프로파일의 장점을 가지고 있기 때문에, transcriptome 분석을위한 선호하는 방법으로 DNA의 microarrays를 대체하는 디지털 형 자료 (모든 증명서의 사본 번호)를 제공하고 알려진 게놈의 sequen에 의존하지 않습니다CE 3.

여기, 우리는 함께 또는 트롬빈 치료없이 인간의 폐 microvascular 내피 세포에 프로필 transcriptomes에 RNA-seq를 적용 할 수있는 완전하고 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 자격이 최근 출판 연구에 기초가 성공적으로 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 첫 번째 전체 transcriptome 분석을 수행하는 4 "RNA-seq은 트롬빈으로 치료 인간의 폐 Microvascular 내피 세포의 유전자와 Isoforms의 소설 Transcriptome를 보여" 트롬빈은 RNA-seq을 사용하여 치료. 그것은 염증 조건, 암, 당뇨병, 관상 동맥 심장 질환의 pathogenesis에 트롬빈로 인한 내피 기능 장애의 근간이 분자 메커니즘에 통찰력을 얻기 위해 추가 실험을위한 전례없는 자원을 굴복, 이러한 질병에 대한 치료 타겟에 대한 잠재적 인 새 리드를 제공합니다.

이 프로토콜의 설명 텍스트네 부분으로 나누어 져 있습니다. 첫 번째 부분은 트롬빈과 RNA 분리, 품질 분석 및 정량화와 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 치료에 대해 설명합니다. 두 번째 부분은 도서관 건설 및 시퀀싱에 대해 설명합니다. 세 번째 부분은 데이터 분석에 대해 설명합니다. 네 번째 부분은 RT-PCR 검증 분석을 설명합니다. 몇 가지 주요 단계를 대표 결과가 표시됩니다. 주요 단계에서의 성공을 높일 수 유용한 팁이나주의 사항은 토론 섹션에서 제공됩니다. 이 프로토콜은 트롬빈로 치료 인간의 폐 microvascular 내피 세포를 사용하지만, 그것은 포유류와 비 포유류의 세포 모두에서 서로 다른 자극이나 억제제, 또는 건강 상태 사이의 셀이나 조직에 transcriptomes를 비교로 치료 조직의 프로필 transcriptomes에 일반화 할 수 및 질병 상태.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜을 요약 순서도는 그림 1에 표시됩니다.

1. 트롬빈, RNA 분리, RNA의 품질 평가 및 정량화와 세포의 치료

  1. 5% FBS, 성장 요인 및 항생제와 EGM-2 중간에 6 잘 접시에 90~100%의 합류로 문화 인간 폐 Microvascular 내피 세포 (HMVEC-LBl) (Lonza, 고양이 # CC-3202).
  2. 기아 미디어 (0 % FBS) 이전 트롬빈 치료를 30 분에 미디어를 변경합니다.
  3. 0.05 U / ML 트롬빈으로 세포를 치료하거나 ° C 5 % CO 2 37에서 6 시간에 대한 제어로 치료 둡니다.
  4. 제조업체의 지침에 따라 Ambion 미르 Vana 키트를 사용하여 처리 및 제어 세포로부터 총 RNA를 분리합니다.
  5. Experion 자동 전기 영동 역 (에서 표준 프로토콜에 따라 Experion StdSense의 진핵 세포 RN​​A 칩과 RNA의 품질을 평가= "_blank"> www.bio-rad.com).
  6. 표준 분광 방법을 사용하여 RNA을 수량화.

2. 도서관 건축 장면....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 단계의 경우 : 28s : 18의 비율은 전통적으로 RNA 저하의 지표로 사용됩니다. 이상적으로, 28s 피크는 18 밴드 (2의 비율)의 약 두 배 공간을 갖추고해야하지만이 이상적인 비율은 자주 연습에서 볼 수 없습니다. 또한, 28s : 분광 방법에서 얻은 18 비율은 RNA의 저하의 양을 과소 평가 할 수 있습니다. 보다 정확하게 저하, 따라서 RNA 샘플의 품질을 수량화하기 위해 Experion 시스템은 RNA 품질 표시 (RQI) 번호를 계산합니다. RQI 알고리즘은 표준화 저하 RNA 샘플의 시리즈에서 데이터 RNA 샘플의 electropherogram을 비교하여 자동으로 10 일 (그대로 RNA)과 1 (저하 RNA) 사이의 숫자를 반환합니다. RNA 품질이 8보다 이상적으로 큰 최소 7의 RQI을 가지고 있어야합니다. 그림 2는 8.4의 RQI과 높은 품질의 RNA 샘플을 사용하여 Experion 결과를 보여줍니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

주요 단계

RNA 처리 : RNases는, 가장 높은 품질의 RNA를 저하됩니다 따라서 치료는 RNA (10)의 분리, 저장, 사용하는 동안주의해야합니다. 장갑은 항상 인간의 손에있는 RNases하여 오염을 방지하기 위해 착용하고 있습니다. 장갑은 특히 터치 피부, 문 손잡이 또는 기타 일반적인 표면 후, 자주 변경해야합니다. 피펫의 세트 작업을 RNA에 전적으로 헌신해야하고 모든 팁과 튜브는 RNase 무료이​​어야합니다. RNA 격리 및 응용 프로그램 하류는 정기적으로 이러한 RNase-해치와 같은 제품과 함께 소독 아르 트래픽이 낮은 지역에서 수행해야합니다. 저하는 반복 냉동 해동 사이클 발생할 수 있습니다. 이러한 고립 즉시 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 RNA를 aliquoting하여 최소화 할 수 있습니다. 또는 cDNA 직접 고립 된 이후로 qRT-PCR과 같은 다운 스트림 응용 프로그램에 만들 수 있습니다. RNA.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 우리의 데이터 분석을 위해 자신의 컴퓨팅 클러스터의 사용에 대한 어린이의 자비 병원 및 클리닉에서 박사 스티븐 Kingsmore 및 소아 게놈 의학 센터에 진심으로 감사드립니다, Illumina의 현장 서비스 팀 (엘리자베스 Boyer, 스콧 쿡과 마크 쿡) 및 기술 자신의 빠른 응답 및 차세대 DNA 시퀀싱 장비, HiScanSQ, 데이터 품질 분석의 실행에 대한 유용한 제안에 대한 컨설턴트 팀. 이 작품은 건강 기금 HL080042 (SQY까지) 국립 연구소에 의해 일부 지원과 어린이의 자비 병원과 클리닉의 시동 기금과 기금, 캔사스 시티의 미주리 대학 (SQY까지).되었습니다

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
시약 및 장비 회사 카탈로그 번호 코멘트
인간 폐 Microvascular 내피 세포 Lonza CC-2815
Lonza, 글 머리 기호 키트 Lonza CC-3202 EGM-2, FBS, 성장 요인 및 항생제를 포함
트롬빈 시그마 T4393
Ambion 미르 Vana 키트 생명 기술 오전 1560
RNase-해치 생명 기술 AM9782
Experion StdSens RNA 바이오 RAD 700-7103
TruSeq RNA 준비키트 Illumina FC-122-1001
AMPureXP 비즈 Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 A63881
어깨 역 Transcriptase II 생명 기술 18064-014
Experion DNA의 1K 바이오 RAD 700-7107
QuantiTect SyberGreen Qiagen 204163
PE 클러스터 생성 키트 Illumina PE-401-3001
PhiX 제어 키트 Illumina FC110-301
200 사이클 SBS 키트 Illumina FC-401-3001
HiScanSQ * Illumina SY-103-2001
cBot Illumina SY-301-2002
qPCR 기계 - Viia7 생명 기술 모델 # VIIA7 / 장비 # 10631261 또는 동급
Experion 시스템 바이오 RAD 7007001 Bioanalyzer는 다른 시스템입니다
분광 광도계 바이오 테크 시대 Microplate 분광 또는 동급
원심 분리기 - Sorvall 전설 XTR 열 과학 75004521 또는 동급
자기 스탠드 생명 기술 AM10027
thermocycler 96 - 웰 일반 실험실 공급 업체
주요 시약 및 주요 E 표 3. 목록quipment. * 동영상에서는 대신 HiScanSQ의 HiSeq1000이 입증되었습니다.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
  3. Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA seq AnalysisTranscriptome ProfilingThrombin TreatmentHuman Pulmonary Microvascular Endothelial CellsRNA IsolationLibrary ConstructionData AnalysisRT PCR ValidationHighSeq 1000Cuffdiff Analysis

Related Articles