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방법 논문

이미징은 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 수용체 삽입을 pHluorin 태그

12.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/4450

⸱

2012년 11월 20일

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Jackson Laboratory

이 논문에서

요약

태그를 추가하여 superecliptic pHluorin와 막 수용체의 세포 외 도메인, 및 이미징에 의해 배양 된 마우스 뉴런에서 이러한 퓨전 수용체, 우리는 직접 플라즈마 막에 수용체의 개별 기공을 갖는 삽입 이벤트를 시각화 할 수 있습니다. 이 기술은 플라즈마 막에 수용체 삽입에 관한 분자 메커니즘을 elucidating에 도움 될 것입니다.

초록

플라즈마 막 (PM)와 세포 내 구획 사이의 수용체 거래에 관한 메커니즘의 이해 뛰어난 공간과 시간적 해상도와 실험 방법이 필요합니다. 또한, 이러한 접근은 또한 세포 내 구획에있는 사람들의 PM에 지역화 수용체를 구별 할 수있는 능력이 있어야합니다. 각 소포는 수용체 만 소수를 운반 때문에 가장 중요한 것은, 하나의 소포에 수용체를 감지하는 것은, 뛰어난 감지 감도를 필요로합니다. 와 세포의 화학적 고정을 필요로 immunolabeled 표면 수용체의 형광 현미경 검사, 따라서 충분한 시간적 해상도 1-6 부족, 수용체 거래를 검사에 대한 표준 접근 방식은 필요한 공간과 시간적 해상도를 모두 부족 생화학 감지, 다음 표면 biotinylation이 포함되어 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리와 다른 사람들은 개발하고 새로운 stra을 고용했습니다7-17 뛰어난 공간과 시간적 해상도 PM에 수용체의 동적 삽입 시각화 수 있습니다 tegy 그. 방법은 수용체의 N-터미널 세포 도메인에 산도에 민감한 GFP, superecliptic pHluorin 18의 태그를 포함하고 있습니다. Superecliptic pHluorin은 산성의 pH를 중성 산도의 비 형광 (산도 <6.0)에서 형광 것의 고유 한 속성이 있습니다. 따라서 태그 수용체가 아닌 형광 때 세포 거래 소포 나 endosomal 구획의 산성 루멘 내에 있으며, 그들은 PM의 외부 표면에 세포 중성 pH의 환경에 노출 한 경우에만 쉽게 시각화된다. 우리의 전략은 결과적으로 우리는 세포 거래 소포 내에 이러한에서 PM 표면 수용체를 구별 할 수 있습니다. 충분한 공간과 시간적 해상도뿐만 아니라 수용체의 동적 인신 매매를 연구하는 데 필요한 감도를 달성하기 위해, 우리는 고용 반영 내부 전체우리는 광학 이미징 (~ 170 nm 정도)의 최적의 공간 해상도를 달성하기 위해 활성화 이온 형광 현미경 (TIRFM)는, 비디오 속도 현미경 (30 프레임 / 초), 그리고 감도의 시간 해상도는 단일 GFP의 형광 검출 방법 분자. 영상으로 TIRFM에 따라 수용체, 우리가 직접 각각의 수용체 삽입 행사 교양 뉴런의 PM에를 시각화 할 수 있었다 pHluorin는 태그. 이 영상 접근법은 잠재적으로 superecliptic pHluorin로 표시 될 수 세포 도메인으로 모든 막 단백질에 적용 할 수 있으며, 다른 막 단백질 (수용체, 이온 채널, 운반 등)의 삽입을 위해 운영 주요 자세한 메커니즘 절개를 수 PM.

프로토콜

1. Neuronal 문화 컨디셔닝을 위해 마우스 Glia 문화 준비

  1. T75 플라스크는 콜라겐 솔루션 (ddH 2 O의 Purecol의 1시 3분 희석)로 코팅되어 있습니다. 플라스크는 수직으로 설정하고 조직 문화 후드에서 하룻밤 건조 남아 있습니다.
  2. 해부 버퍼 (aCSF : 119 MM NaCl, 5 MM KCl, 1 MM MgCl 2, 30 MM 덱스 트로 오스, 25 밀리미터 HEPES, 칼슘없이 산도 7.4)과 glia 미디어 (DMEM 10 % FBS, 10 단위 / ML 페니실린, 10과 보충 μg / ML의 스트렙토 마이신, 그리고 Glutamax)는 ° C 사용을위한 준비가 될 때까지 준비 및 4에 저장됩니다.
  3. glia 문화의 날, glia 미디어는 마우스 뇌의 해부하기 전에 37 ° C의 물을 욕조에 최소 30 분 동안 데워 있습니다. 배아 또는 신생아 쥐들이 빠른 목 베기에 의해 euthanized 있습니다. 뇌성 cortexes은 해부 현미경 아래에서 해부하고 있습니다.
  4. 해부하는 뇌 조직은 37 papain 솔루션 (100 ML papain, 2 ML의 해부 버퍼 20 μl 1% DNase I)에 소화 ° C 구경R 20 분.
  5. papain을 소화 따라, 뇌 조직은 10 ML 미리 예열 glia 미디어로 헹구어 있습니다. 신선한 glia 미디어 (2 ML)은 다음 소화 뇌 조직에 추가되고, 조직은 불타는 광택 유리 파스퇴르 피펫으로 triturated 있습니다.
  6. 신선한 glia 미디어 (8 ML)는 dissociated 조직에 추가됩니다. 70 μm 셀 스트레이너는 dissociated 조직 정지를 필터링하는 데 사용됩니다. 셀은 다음 T75 플라스크 (보통 2-3 배아 수있는 씨앗이 한 T75 플라스크)에 놓는과 37 ° C 세포 배양 인큐베이터에 배치됩니다.
  7. 다음 날은 T75 플라스크에서 미디어가 흡입된다. 플라스크는 10 ML PBS로 헹구어 있습니다. 신선한 glia 미디어 (10-15 ML)는 다음 각 플라스크에 추가됩니다.
  8. 10-12일 내에 T75 플라스크에 glia이 합류해야합니다. Glial 세포는 PBS로 헹구어되며, 0.05 % 트립신의 5 ML은 각 T75 플라스크에 추가됩니다.
  9. 5 분에 대한 ° C 37 번 트립신의 부화 후, glial 세포가 각각 T75 플라스크에서 dissociated와 glial 세포가 두 개로 분할 아르다른 콜라겐 - 코팅 T75 플라스크.
  10. 문화 삽입 (Millipore PICM03050)는 6 잘 접시, 콜라겐 코팅을하고, 하루 아침에 공기 건조에 붙여 넣어 준비가되어 있습니다. Glia 미디어 (2 ML 각) 각 문화 삽입 아래에 배치됩니다.
  11. 합류 T75 플라스크에서 Glia는 trypsinized (6 - 잘 접시 당 하나의 T75 플라스크, 2 ML 각 삽입) 문화 삽입에 놓는 있습니다. 이 glia 문화 삽입은 조건 neuronal 문화를하는 데 사용됩니다.

2. Neuronal 문화

  1. neuronal 문화 유리 coverslips은 70 %에 최소 하루 아침에 HNO 3 몸을 담글 수에 의해 청소됩니다. Coverslips 그 다음 ddH 2 O 적어도 3 번과 세척, 그리고 (> 200 ° C) 밤 Isotemp 오븐에서 건조됩니다.
  2. 청소 coverslips는 6 잘 플레이트, 잘 당 하나의 coverslip에 배치됩니다. Coverslips는 폴리-L-라이신 솔루션 (100 MM 붕산 2 ML, 0.1 %, 산도 = 8.5) 37 ° C 배양기에서 하룻밤으로 코팅되어 있습니다.
  3. 폴리-L-라이신 솔루션은 coverslips에서 제거되고 coverslips는 autoclaved ddH 2 O.으로 3 번 씻어 아르 Coverslips 그런 다음 37 incubated 아르 (Neurobasal 5 % 열 inactivated 말 혈청, 10 단위 / ML 페니실린, 10 μg / ML 스트렙토 마이신, Glutamax로 보​​충 도금 미디어에서 밤새 ° C 배양기, 도금 매체에 추가됩니다 2퍼센트 B27 보충 하루에)이 사용됩니다.
  4. B-27와 다음 날, 도금 미디어가 제거되고 신선한 도금 매체 2 ML은 유리 coverslip이 각 잘에 추가됩니다.
  5. 임산부 마우스 (E15-18)은 CO 2 euthanized되며, 배아 쥐들이 목 베기에 의해 euthanized 있습니다. 해마 나 striatum은 뇌 조직에서 해부하는 각각 hippocampal 뉴런 또는 striatal 중간 가시의 뉴런의 문화 얼음처럼 차가운 분해 버퍼와 15 ML 원뿔 튜브에 배치됩니다.
  6. 단계 1.4) 및 1.5)에 설명 된대로 해부하는 뇌 조직은 papain과 dissociated 있습니다.
  7. 에프해리 따르게 각 neuronal 정지 세포의 수는 hemocytometer로 계산됩니다. 뉴런은 다음 6 잘 접시의 당 잘 0.4 X 10 6 세포의 밀도 각 coverslip에 놓는, 그리고 37 ° C 배양기 새벽에 배양합니다 (뉴런이 DIV 0아르).
  8. 에어컨 neuronal 문화에 대한 glia 문화 삽입을 준비하려면, glia 미디어는 glia 문화 삽입에서 제거하고 신선한 도금 매체는 (삽입 아래에 삽입 2 ML 2 ML) 추가됩니다.
  9. 다음 날 (DIV 1), 뉴런과 coverslips는 glia 문화 삽입, 각도에 한 coverslip 아래에 배치됩니다.
  10. 그들은 transfection 및 이미징 실험을위한 준비가 될 때까지 뉴런은 신선한 미리 데워 먹이 미디어 (B-27 포함) 모든 3~4일의 절반 볼륨으로 공급하고 있습니다.

3. Transfection

  1. Neuronal transfection은 Lipofectamine 2000을 사용하여 수행됩니다. 각 neuronal 문화 (coverslip 당 하나의 문화), 2 μlLipofectamine 2000 및 DNA 1 μg이 사용됩니다. 더 보충과 신선한 Neurobasal 매체가 Lipofectamine와 DNA를 희석하는 데 사용됩니다.
  2. DNA와 Lipofectamine은 혼합 후 실온에서 20 분에 incubated 수 있습니다.
  3. 각 삽입 내에서 각 glia 문화 삽입 아래에서 미디어 1 ML, 1 ML을 저장하고 원추형 튜브로 미디어를 전송합니다. 37 번 저장 매체와 배양 ° C.에 먹이 미디어의 같은 볼륨 + B27를 추가합니다 이 매체는 transfection 후 neuronal 문화에 사용됩니다.
  4. 20 분 Lipofectamine / DNA 부화 후, glia 문화 삽입은 6 잘 플레이트에서 일시적으로 제거됩니다. 200 μl Lipofectamine / DNA 혼합물은 뉴런 각 coverslip에 추가됩니다. glia 문화 삽입은 다음 뉴런 위의 각도에 반환됩니다. 문화 삽입의 멤브레인에 따라 거품의 생성은 피해야합니다. 뉴런은 2-4 시간에 37 ° C에서 Lipofectamine / DNA 혼합물에 incubated 수 있습니다.
  5. 일 후전자 2-4 시간의 잠복기는 glia 삽입 다시 제거됩니다. Lipofectamine / DNA을 담은 문화 미디어는 각도에서 제거됩니다. 단계 3.3)에 저장된 미디어는 뉴런 (2 ML 잘 당)에 추가됩니다. Glia 문화 삽입은 각도에 반환되며, 각각의 삽입에서 glia 미디어가 제거되며, 단계 3.3)에서 미디어의 2 ML은 각 삽입에 추가됩니다.
  6. 뉴런은 TIRF 영상 전에 transfected cDNA의 표현은 이러한 뉴런에 수행 수 있도록 추가 24-72 시간에 배양되어 있습니다.

4. TIRF 영상

  1. 인공 뇌척수 (aCSF : 119 MM NaCl, 2.5 MM KCl, 30 MM 포도당, 2 MM CaCl 2, 1 MM MgCl 2, 25 MM HEPES, = 7.4 산도)는 실시간 영상 실험에 사용됩니다. 우리 TIRF 영상 시스템은 여기에 100 MW 청록색 레이저로 맞춤 설정이며, 전자 배가 요금은 검출기에 대한 장치 (EMCCD) 카메라를 결합.
  2. 이미징 실험에 앞서, aCSF은 37 & D에 경고합니다예를 들어, 최소 30 분을위한 C 물 목욕. 라이브 영상에 대한 가열 삽입은 현미경 스테이지에 배치되며, 가열 삽입, 레이저, 카메라가 이미징 실험을 시작하기 전에 최소 30 분 동안 따뜻하게합니다.
  3. transfected 뉴런과 coverslip은 라이브 이미징 챔버로 조립된다. 챔버가 조립 한 후 미리 예열 aCSF은 챔버에 배치됩니다,이 단계는 가능한 한 빨리 완료해야합니다.
  4. 챔버는 현미경 무대에서 가열 삽입에 배치되면, transfected 뉴런은 시각적으로 에피 형광 이미징 모드에서 확인할 수 있습니다.
  5. 건강 transfected 뉴런은 (그림 1과 2 참조) 확인 후 플라즈마 막에 pHluorin - 수용체가 매우 높은 형광 수준의 때를 같이, 우리는 일반적으로 플라즈마 막에 기존 pHluorin의 형광을 제거하는 사진 표백제의 1 분을 수행 TIRF 영상이 처음 시작되어있는 개별 기능의 시각화를 방해ertion 이벤트.
  6. photobleach 후, EMCCD 카메라의 전자 증 배기의 게인 설정이 최대로 설정되어 있으며, 녹화 10 Hz에서 1 분을 위해 수행됩니다.
  7. 각 기록은 600 이미지가 포함됩니다. 개인 삽입 이벤트는 ImageJ를 사용하여 녹화를 다시 재생하여 확인할 수 있습니다. 개인 삽입 이벤트가 수동으로 ImageJ를 사용하여 분석하고 있습니다.

5. 대표 결과

일관성 neuronal 문화는 성공적으로 라이브 영상 실험의 핵심입니다. 그림 1은 마우스 hippocampal 뉴런이 18 사업부하기 위해 DIV 11 일부터 우리의 프로토콜을 사용하여 배양 보여줍니다. 그것은 뉴런이 광범위한 프로세스를 개발하고 있다는 한 이미지에서 수지상 프로세스가 수지상 쪽이 뉴런이 문화에 건강하다고 징후와 밀도가 덮여 분명하다. 우리의 문화 프로토콜은 뇌의 뉴런의 다른 유형을 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 최근의 문화에이 프로토콜을 사용교양 마우스 striatal 중간 가시의 뉴런 9 도파민 D2 수용체 (DRD2) 삽입을 시험하는 연구 striatal 중간 가시의 뉴런. 그림 2는 마우스 striatal 매체 가시의 뉴런이 DIV 8시에 우리의 프로토콜을 사용하여 배양 보여줍니다. 또한, 우리는 성공적으로 신경이 유형의 superecliptic pHluorin 태그 DRD2s의 TIRF 영상을 수행했습니다. 그림 3의 표현을 보여줍니다 pHluorin 태그이 신경 세포에서 산도 - DRD2 삽입 중간 가시의 뉴런 및 시각화에 DRD2 (산도 - DRD2).

figure-protocol-1
인터페이스의 문화 방법을 사용하여 그림 1. 마우스를 hippocampal 문화. DIV : 체외의 일, 문화의 날은 DIV 0으로 간주됩니다. 이미지에서, 그것은 분명입니다 DIV 11 DIV 15 일까지 문화의 유형의 성숙한 hippocampal 뉴런. DIV 11 13, neuronal 수석은 filipodia와 미숙 한 쪽으로 덮여 있습니다. DIV 15시18, neuronal 수석은 큰 쪽과보다 성숙한 뉴런의 표시를 적용하고 있습니다. 왼쪽 패널 : 낮은 배율 다른 연령대에 마우스를 hippocampal 뉴런의 이미지. 오른쪽 패널 : 높은 배율의 이미지 (왼쪽 패널의 neuronal 수석을 확대) 다른 연령대에서 수지상 쪽과 neuronal 수지상 프로세스.

figure-protocol-2
인터페이스의 문화 방법을 사용하여 그림 2. 마우스 striatal 중간 가시 뉴런 문화. 이미지의 뉴런은 DIV 8 이용하실 수 있습니다.

figure-protocol-3
그림 3. 슈퍼 황도 pHluorin 태그 도파민 D2 수용체 (산도 - DRD2)와 transfected 마우스 striatal 중간 가시의 뉴런. 왼쪽의 이미지는 시간 경과 기록의 최대 강도 투사 (600 이미지, 이미지 당 100 밀리 초)입니다. 화이트 화살촉은 산도-D의 개별 기공을 갖는 삽입을 나타냅니다RD2. 이 이미지는 XY 치수에 삽입 정보를 유지하지만 시간 정보를 잃는다. 오른쪽 이미지는 xyt 스택이 y 축 중심으로 회전 90도이며, 각각의 X 축 라인의 최대 픽셀이 하나의 y 축 픽셀에 투영되는, YT 최대 강도 투영을 보여줍니다. 이 이미지는 YT 축을 따라 삽입 정보를 유지하지만 X 축 정보를 잃는다.

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토론

알 수없는 이유로, 마우스 뉴런은 항상 쥐 뉴런보다 문화에 더 어렵습니다. 우리의 경험에서, 뉴런과 glia의 혼합 문화는 기본 교양 마우스 뉴런에 적합합니다. neuronal somata 및 TIRF 현미경의 범위 이외의 수지상 프로세스를 situating, glia 세포의 상단에 성장하는 경향이 문화 뉴런과 프로세스의이 유형에서와 같이 그러나, 이러한 혼합 문화, TIRF 영상 실험에 적합하지 않습니다. 따라서 coverslip에 몇 glia과 낮은 밀도 neuronal 문화는 TIRF 영상에 이상적입니다. 배양 접시의 바닥이 glia에 놓는 있으며, 뉴런이 coverslip에 놓는되고 문화 접시에 거꾸로 배치하는 20 일, 우리는 먼저 은행원 방법 19 테스트. coverslip과 glia 층은 coverslip에 왁스의 세 작은 물방울로 구분됩니다. 이 방법은 작은 크기의 coverslips (예 : 15 mm 또는 18 mm coverslips)에 대해 잘 작동하지만, 우리는 2...

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공개 사항

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감사의 글

이 작품은 잭슨 연구소에서 시작 기금에 의해 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
이름 회사 소개 카탈로그 번호 코멘트
정화 소 콜라겐 솔루션 (Purecol) 고급 Biomatrix 5005-B
행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) GIBCO 14185-045
페니실린 - 스트렙토 마이신 (펜 패 혈성) GIBCO 15140-122
나트륨 pyruvate GIBCO 11360-070
DMEM 높은 혈당 GIBCO 10313-021
태아 소 혈청 (FBS)
GlutaMAX GIBCO 35050-061
papain 워싱턴 생물 화학 주식회사 LS003126
Deoxyribonuclease I (DNase I) 시그마 DN25-10MG
Dulbecco의 인산은 (DPBS) 식염 버퍼 GIBCO 14190-144
0.05 % 트립신 GIBCO 25300-054
폴리-L-라이신의 브롬화 수소산 시그마 P2636-1G
붕산 피셔 - 과학 BP 168-500
Neurobasal 중 GIBCO 21103-049
B-27 세럼 - 무료 보충 GIBCO 17504-044
열 비활성 말 혈청 GIBCO 26050-070
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11,668 019
HEPES 피셔 - 과학 BP310-500
문화 삽입 Millipore PICM03050

참고문헌

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