태그를 추가하여 superecliptic pHluorin와 막 수용체의 세포 외 도메인, 및 이미징에 의해 배양 된 마우스 뉴런에서 이러한 퓨전 수용체, 우리는 직접 플라즈마 막에 수용체의 개별 기공을 갖는 삽입 이벤트를 시각화 할 수 있습니다. 이 기술은 플라즈마 막에 수용체 삽입에 관한 분자 메커니즘을 elucidating에 도움 될 것입니다.
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이 논문에서
요약
초록
플라즈마 막 (PM)와 세포 내 구획 사이의 수용체 거래에 관한 메커니즘의 이해 뛰어난 공간과 시간적 해상도와 실험 방법이 필요합니다. 또한, 이러한 접근은 또한 세포 내 구획에있는 사람들의 PM에 지역화 수용체를 구별 할 수있는 능력이 있어야합니다. 각 소포는 수용체 만 소수를 운반 때문에 가장 중요한 것은, 하나의 소포에 수용체를 감지하는 것은, 뛰어난 감지 감도를 필요로합니다. 와 세포의 화학적 고정을 필요로 immunolabeled 표면 수용체의 형광 현미경 검사, 따라서 충분한 시간적 해상도 1-6 부족, 수용체 거래를 검사에 대한 표준 접근 방식은 필요한 공간과 시간적 해상도를 모두 부족 생화학 감지, 다음 표면 biotinylation이 포함되어 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리와 다른 사람들은 개발하고 새로운 stra을 고용했습니다7-17 뛰어난 공간과 시간적 해상도 PM에 수용체의 동적 삽입 시각화 수 있습니다 tegy 그. 방법은 수용체의 N-터미널 세포 도메인에 산도에 민감한 GFP, superecliptic pHluorin 18의 태그를 포함하고 있습니다. Superecliptic pHluorin은 산성의 pH를 중성 산도의 비 형광 (산도 <6.0)에서 형광 것의 고유 한 속성이 있습니다. 따라서 태그 수용체가 아닌 형광 때 세포 거래 소포 나 endosomal 구획의 산성 루멘 내에 있으며, 그들은 PM의 외부 표면에 세포 중성 pH의 환경에 노출 한 경우에만 쉽게 시각화된다. 우리의 전략은 결과적으로 우리는 세포 거래 소포 내에 이러한에서 PM 표면 수용체를 구별 할 수 있습니다. 충분한 공간과 시간적 해상도뿐만 아니라 수용체의 동적 인신 매매를 연구하는 데 필요한 감도를 달성하기 위해, 우리는 고용 반영 내부 전체우리는 광학 이미징 (~ 170 nm 정도)의 최적의 공간 해상도를 달성하기 위해 활성화 이온 형광 현미경 (TIRFM)는, 비디오 속도 현미경 (30 프레임 / 초), 그리고 감도의 시간 해상도는 단일 GFP의 형광 검출 방법 분자. 영상으로 TIRFM에 따라 수용체, 우리가 직접 각각의 수용체 삽입 행사 교양 뉴런의 PM에를 시각화 할 수 있었다 pHluorin는 태그. 이 영상 접근법은 잠재적으로 superecliptic pHluorin로 표시 될 수 세포 도메인으로 모든 막 단백질에 적용 할 수 있으며, 다른 막 단백질 (수용체, 이온 채널, 운반 등)의 삽입을 위해 운영 주요 자세한 메커니즘 절개를 수 PM.
프로토콜
1. Neuronal 문화 컨디셔닝을 위해 마우스 Glia 문화 준비
- T75 플라스크는 콜라겐 솔루션 (ddH 2 O의 Purecol의 1시 3분 희석)로 코팅되어 있습니다. 플라스크는 수직으로 설정하고 조직 문화 후드에서 하룻밤 건조 남아 있습니다.
- 해부 버퍼 (aCSF : 119 MM NaCl, 5 MM KCl, 1 MM MgCl 2, 30 MM 덱스 트로 오스, 25 밀리미터 HEPES, 칼슘없이 산도 7.4)과 glia 미디어 (DMEM 10 % FBS, 10 단위 / ML 페니실린, 10과 보충 μg / ML의 스트렙토 마이신, 그리고 Glutamax)는 ° C 사용을위한 준비가 될 때까지 준비 및 4에 저장됩니다.
- glia 문화의 날, glia 미디어는 마우스 뇌의 해부하기 전에 37 ° C의 물을 욕조에 최소 30 분 동안 데워 있습니다. 배아 또는 신생아 쥐들이 빠른 목 베기에 의해 euthanized 있습니다. 뇌성 cortexes은 해부 현미경 아래에서 해부하고 있습니다.
- 해부하는 뇌 조직은 37 papain 솔루션 (100 ML papain, 2 ML의 해부 버퍼 20 μl 1% DNase I)에 소화 ° C 구경R 20 분.
- papain을 ....
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토론
알 수없는 이유로, 마우스 뉴런은 항상 쥐 뉴런보다 문화에 더 어렵습니다. 우리의 경험에서, 뉴런과 glia의 혼합 문화는 기본 교양 마우스 뉴런에 적합합니다. neuronal somata 및 TIRF 현미경의 범위 이외의 수지상 프로세스를 situating, glia 세포의 상단에 성장하는 경향이 문화 뉴런과 프로세스의이 유형에서와 같이 그러나, 이러한 혼합 문화, TIRF 영상 실험에 적합하지 않습니다. 따라서 coverslip에 몇 glia과 낮은 밀도 neuronal 문화는 TIRF 영상에 이상적입니다. 배양 접시의 바닥이 glia에 놓는 있으며, 뉴런이 coverslip에 놓는되고 문화 접시에 거꾸로 배치하는 20 일, 우리는 먼저 은행원 방법 19 테스트. coverslip과 glia 층은 coverslip에 왁스의 세 작은 물방울로 구분됩니다. 이 방법은 작은 크기의 coverslips (예 : 15 mm 또는 18 mm coverslips)에 대해 잘 작동하지만, 우리는 2.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
이 작품은 잭슨 연구소에서 시작 기금에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 이름 회사 소개 카탈로그 번호 코멘트 | |||
| 정화 소 콜라겐 솔루션 (Purecol) | 고급 Biomatrix | 5005-B | |
| 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) | GIBCO | 14185-045 | |
| 페니실린 - 스트렙토 마이신 (펜 패 혈성) | GIBCO | 15140-122 | |
| 나트륨 pyruvate | GIBCO | 11360-070 | |
| DMEM 높은 혈당 | GIBCO | 10313-021 | |
| 태아 소 혈청 (FBS) | |||
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| papain | 워싱턴 생물 화학 주식회사 | LS003126 | |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | 시그마 | DN25-10MG | |
| Dulbecco의 인산은 (DPBS) 식염 버퍼 | GIBCO | 14190-144 | |
| 0.05 % 트립신 | GIBCO | 25300-054 | |
| 폴리-L-라이신의 브롬화 수소산 | 시그마 | P2636-1G | |
| 붕산 | 피셔 - 과학 | BP 168-500 | |
| Neurobasal 중 | GIBCO | 21103-049 | |
| B-27 세럼 - 무료 보충 | GIBCO | 17504-044 | |
| 열 비활성 말 혈청 | GIBCO | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11,668 019 | |
| HEPES | 피셔 - 과학 | BP310-500 | |
| 문화 삽입 | Millipore | PICM03050 |
참고문헌
- Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
- Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and syn....
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재인쇄 및 허가
