트립신과 Passaging 색채 인간의 배아 줄기 세포 - 라인

요약

이 비디오에서 우리는 우리의 실험실은 정기적으로 트립신과 색채 인간 배아 줄기 세포 라인을 통로 방법을 보여줍니다.

초록

이 비디오에서 우리는 우리의 실험실은 정기적으로 트립신과 색채 인간 배아 줄기 세포 라인을 통로 방법을 보여줍니다. 인간 배아 줄기 세포는 세포 배양의 유물이며, 높은 인구 doublings와 karyotypic 이상을 취득하는 경향이 있습니다. 적절한 passaging은 건강, undifferentiated, karyotypically 정상적인 색채에게 인간의 배아 줄기 세포 배양을 유지하기위한 필수적입니다. 첫째, 확장 문화 잔류 미디어와 세포 부스러기를 제거하기 위해 PBS에 씻어, 그러면 세포는 따뜻한 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 최소 볼륨 겹쳐 있습니다. 트립신은 최대 5 분 동안 세포에 남아있다, 그때 전지 부드럽게 2mL serological 피펫과 dislodged 수 있습니다. 세포 현탁액은 색채 미디어의 큰 볼륨과 수집 및 혼합이며, 그 세포는 부드러운 원심 분리에 의해 저장됩니다. inactivated 트립신 미디어 혼합물을 제거하고, 세포 사전 예열 색채 미디어에 resuspended 있습니다. 적절한 분할 비율 (일반적으로 1시 10분에서 1시 20분까지) 계산하고, 조사 마우스 배아 fibroblast 피더 세포 monolayer를 포함 1~2일 된 판에 다시 도금 세포. 새로 씨앗 색채 문화 플레이트가 48 시간에 대해 그대로 남아 있습니다 다음, 미디어 이후 매일 변경됩니다. 이 karyotypic 이상을 도입의 위험을 증가로 그것은 하나의 세포 현탁액로 trpsinize하지 않는 것이 중요합니다.

프로토콜

일반

우리는 쉽게 처리하기 위해 주어진 시간에 더 이상보다 샘플을 해동하는 것이 좋습니다. 핸들러는 오랜 기간 동안 실내 온도와 낮은 CO2의 문화를 떠나지 않도록주의를 기울여야한다. 라이브 세포의 모든 원심 분리는 상온에서 5 분 500-600 XG에서 이루어집니다.

MEFs (마우스 배아 피더 세포)

1. 37 사전 따뜻한 MEF 미디어 ° C. -80에서 MEF의 약병을 제거 ° C 즉시 잠수함 37 ° C 물 욕조에서 튜브의 아랫부분. 세포는 80 % (왼쪽 작은 부분 냉동) 해동되기 전에는 30~45초 정도 걸릴 것입니다.
2. 신속 튜브는 층류 후드에 가지고 70 %의 알코올로 아래로 스프레이하고, 사전 예열 미디어 세포를 전송할 수 있습니다.
3. 이전 준비 접시에서 젤라틴 솔루션을 대기음.
4. 여섯 우물의 각에 드롭 현명한 방식으로 MEF 솔루션의 나누어지는 2 ML. 잘 대해 균일하게 MEFs를 배포해야합니다. MEFs가 번호판에 첨부할 수 있도록 밤새 MEF 판, 그리고 37 ° C 배양기에서 개최 날짜입니다.
5. 6 시간 만에 MEFs는 접시에 첨부됩니다. MEF 접시 도금 후 24~48시간를 사용하는 것....

토론

이 비디오에서 우리는 우리의 연구실에서 어떻게 정기적으로 통과 색채 인간 배아 줄기 세포 라인을 보여주었다. 효율적이고 정기적으로 분할하고 passaging는 건강한 인간 배아 줄기 세포 라인을 유지하기위한 필수적입니다. 트립신의 중재 통로는 색채 셀 라인의 중요한 장점이다 그러나, 그것은 이상의 문화를 trypsinize하거나 다시 플래팅 동안 단일 세포의 큰 비율을하지 않는 것이 중요합니다.

....

재료

색상 미디어 651.5 ML KO - DMEM 500 ML PenStrep 6.5 ML GlutaMAXTM 6.5 ML NEAA 6.5 ML 2 - 메르 캅 토 에탄올 0.5ul KO 세럼 교체 65 ML Plasmanate 65 ML bFGF2 (10 NG / ML 최종) 0.65 ML