Kupffer의 소포의 유전자 기능 및 속눈썹 생성 된 유체 흐름의 시각화 분석

Summary

Kupffer의 소포에 솜털 생성 된 유체 흐름 (KV)는 zebrafish 배아의 왼쪽, 오른쪽 패턴을 제어합니다. 여기, 우리는 KV 세포에 특별히 유전자 기능을 조절하는 기술을 설명합니다. 또한, 우리는 유체 흐름을 시각화하는 KV에 형광 구슬을 전달하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

같은 심장, 뇌, 그리고 내장 등의 내부 기관은 정상적인 기능 ¹ 중요한 왼쪽, 오른쪽 (LR) asymmetries을 개발할 수 있습니다. 운동성 섬모가 부족해은 마우스, 개구리, 그리고 zebrafish ^2-6 포함한 척추 동물의 배아에 LR을 비대칭 수립에 참여하고 있습니다. 이러한 'LR의 속눈썹은'장기에게 ⁷ 개발을위한 LR의 패턴 정보를 제공하는 것으로 생각되어 왼쪽 측면 판 중배엽에서 층계를 신호 보존 비대칭 결절을 (TGF-β superfamily), 실행하는 데 필요한 비대칭 유체 흐름을 생성합니다. 따라서, LR의 패턴의 근간이 메커니즘을 이해하기 위해, 그것은 LR 솜털이있는 세포의 조직, LR의 속눈썹하고 강력한 비대칭 흐름을 생성하는 능력의 운동성 및 길이를 조절 유전자를 식별하는 것이 중요합니다.

zebrafish 배아에서 LR의 속눈썹은 ^2,4,5 Kupffer의 소포 (KV)에 위치하고 있습니다. KV는 monociliated 상피 세포의 단일 층으로 구성되어 있습니다유체 - 채워진 내강을 둘러싸 그. 운명 매핑은 KV이 epiboly 단계 ^8,9 동안 등쪽 배반 엽 여백에 이전 등쪽 전신 세포 (DFCs)로 알려진 ~ 20-30 셀의 그룹에서 파생되는 것으로 나타났습니다. 초기 체절 단계 동안, DFCs 클러스터와 솜털이있는 상피 세포로 분화가 배아 ^10,11의 tailbud에 KV를 형성합니다. 식별하고 추적 할 수있는 능력을 DFCs을의 조합 광학 투명성과 zebrafish KV LR 솜털이있는 세포를 연구 할 수있는 훌륭한 모델 시스템 배아하게되면 zebrafish의 신속한 개발.

흥미롭게도, DFC / KV 세포 계보 (Lineage)의 progenitors은 4 시간 후 수정을 (hpf)에 난황 세포 사이에 세포질 다리를 유지, 2 hpf ⁸ 후 가까운 난황 세포와 다른 배아 세포 사이에 세포질 다리 반면. 이 세포질 다리 활용, 우리는 morpholino oligonucle를 제공​​ 할 수있는 단계 별 분사 전략을 개발DFCs 및 최저 이러한 세포 ¹² 대상 유전자의 기능에 대한 독점적 otides (MO). 이 기술은 유전자 기능이 야생 형 배아의 맥락에서 개발 DFC / KV 혈통에 쓰러되는 키메라 배아를 생성합니다. KV에서 비대칭 유체 흐름을 분석하기 위해, 우리는 KV 루멘과 videomicroscopy ^2를 사용 기록 비즈 운동으로 형광 microbeads를 삽입. 유체 흐름은 쉽게 시각화하고 시간이 지남에 따라 구슬 변위를 추적하여 정량화 할 수 있습니다.

여기 단계 별 DFC 타겟 유전자 최저 기법과 흐름을 시각화 할 수 KV에 형광 microbeads의 주입을 사용하여, 우리는 KV 개발 및 기능 중에 특정 유전자의 역할을 특성화 할 수있는 효과적인 방법을 제공하는 프로토콜을 제시한다.

Protocol

스테이지 별 Zebrafish의 배아 주사의 개요

대상 mRNA에 바인딩하고 증명서의 단백질 표현을 방해 안티센스 morpholino의 oligonucleotides (MO)는, 널리 연구 zebrafish ^13,14에서 (손실) 함수 유전자 최저에 사용됩니다. 유전자 도구, LLC는 형광 현미경을 사용하여 주입 배아에 MO를 감지 할 수 carboxyfluorescein (녹색 형광을 방출) 또는 lissamine (적색 형광을 방출) 또는 태그가 수법의 살인을 제공합니다. zebrafish 개발의 여러 단계에서 난황 세포에 MO를 주입함으로써, 배아의 특정 구획 (그림 1A-F)에 MO를 제공 할 수 있습니다. MO는 1-4 세포 단계 (0-1 hpf) 32 셀 단계 ¹⁵ 세계 최저를 촉진하기까지 계속 노른자와 연결을 통해 모든 배아 세포를 (그림 1A, D, D ') 입력 사이의 난황에 주입. MO는 midblast 동안 노른자에 주입울라 단계 (2.5-3 hpf)는 특별히 DFC / KV 세포 계보 (Lineage) ^12의 다른 대부분의 배아 세포 lineages를 입력하지 않고 세포질 다리

Results

스테이지 별 MO 주사는 배아의 특정 구획에서 유전자 기능을 분석 할 수있는 유용한 방법을 제공합니다. 그림 1은 유체 흐름을 시각화하는 형광 구슬을 소개하는 DFC / KV 세포와 방법에 유전자 기능을 테스트하는 데 사용되는 분사 전략의 흐름 차트를 제공 KV 인치 성공적인 단계 별 주입 배아의 형광 MO의 배포는 그림 1D-F과 그림 2에서 라이브 배아에서 개략적으로 표시됩니다. 실패 MO 분사는, 난황 셀에 집계 된 MO 남아가 그림 2D에 표시되는 인치

성공적으로 주입 배아 - 선택 형광의 지역화 MO는 - 수 유체 흐름을 분석 할 수있는 KV 루멘 (그림 1G-H)로 형광 microbeads의 제공을위한 4-6 체절 단계에서 설치할 수에 따라. Videomicroscopy는 KV의 구슬 움직임을 (그림 .......

Discussion

DFC / KV 세포 계보 (Lineage)에 MO를 타겟팅 할 단계 별 주사를 사용하여 유전자 기능의 휴대 자율성을 연구하고 글로벌 유전자 최저로 인한 pleiotropic phenotypes을 방지 할 수있는 유용한 방법이다. 그러나, 이러한 주사는 기술적 도전이 될 수 있습니다. 256 전지 및 1,000 세포 단계 사이 MO의 주입이 세 가지 결과가 발생할 수 있습니다 : 1) MO는 난황에 걸쳐 MO의 diffuses)는 주사 사이트 2 집계 유지하고 DFC / KV 셀 또는 3) MO를 입력 난황에 걸쳐 diffuses 및 DFC / KV 세포와 다른 배아 세포를 입력합니다. 따라서, MO는 DFC / KV 셀에 독점적으로 이동되었습니다 된 배아를 선택하면이 실험에서 핵심 단계입니다. 그것은 MO 모든 DFC / KV 셀에로드 할 수 있습니다하는 것이 중요하지만 종종 이러한 세포 ^(10)의 하위 집합 만 들어갑니다. 대상이 모자이크를 근간 이유는 불분명 남아 있지만, 난황 및 / 또는 산업의 폐쇄.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약 / 재료의 이름	회사	카탈로그 번호
표준 제어 태그 oligo-Lissamine	유전자 도구, LLC
사용자 Rock2b morpholino oligo	유전자 도구, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 미크론 마이크로	Polysciences 주식회사	24,054