침샘 조직 문화의 유전자 변형과 재결합

Summary

유전자 전체에서 상피 세포를 조작하는 기술 예 생체 교양 배아 마우스 턱밑의 분비 (SMGs)이 설명되어 있습니다. 이 방법은 상피와 자발적으로 adenoviral 벡터와 상피 초보의 분리 및 감염 후 재결합 할 수 mesenchyme을 SMG의 본래 기능을 활용합니다.

Abstract

morphogenesis을 분기하는 많은 기관의 개발 기간 동안 발생하며, 배아 마우스 턱밑의 선 (SMG)는 morphogenesis을 가지 연구를위한 클래식 모델입니다. ^- 궁극적으로 구강 ^하나에 각각 침을 생산 및 수정 / 전송하기 위해 사용될 acini과 관의 복잡한 분지 네트워크에 상승을 제공하기 위해 상피 봉오리 덕트 형성 단계를 반복 개발 SMG,이 과정은 포함 ^3. 어떻게 세포와 분자 이벤트가 제대로 이해 남아 조정 아르하지만 상피 - 관련 지하 막하고 이러한 세포에 의해 생산 mesenchyme 세포, 성장 인자와 세포 외 기질을 포함하는 중간 엽 구획의 측면은, 분기 메커니즘에 중요한 ^사 . 분자 메커니즘의 연구는 상피 morphogenesis 진행에게 발달 메커니즘에 대한 우리의 이해를 운전 가능한 regener에 대한 통찰력을 제공합니다ative 의학 접근. 이러한 연구는 침 상피의 유전자 조작에 대한 효과적인 방법의 부족으로 인해 방해되었습니다. 현재 adenoviral 도입은 생체 ⁵ 성인 분비에 상피 세포를 타겟팅하는 가장 효과적인 방법을 나타냅니다. 그러나 배아 explants에서 조밀 mesenchyme과 상피 세포를 둘러싸고있는 지하 막는 상피 세포에 바이러스 접근을 막는. mesenchyme가 제거되면, 상피는 adenoviruses를 사용하여 transfected 수 있고, 상피 초보는 Matrigel 또는 laminin-111 ^6,7의 존재에 morphogenesis을 분기 재개 할 수 있습니다. Mesenchyme 무료 상피 흔적 기관의 성장은 수용성 성장 요인으로 추가 보완이 필요하고 그대로 땀샘 ⁸ 발생할 때 완전히 분기 morphogenesis을 요점을 되풀이하지 않습니다. 여기 transfected 전자의 상피 세포와 문화의 adenoviral 전달을 용이하게하는 기술을 설명관련 정보 mesenchyme있는 pithelium. 배아 SMGs, mesenchyme의 제거, 그리고 GFP 함유 아데노 바이러스와 상피의 바이러스 감염의 microdissection 따라, 우리는 상피가 저절로 그대로 SMG 선의 구조를 recapitulating하고 morphogenesis을 분기, 감염되지 않은 mesenchyme과 recombines을 보여줍니다. 유전자 변형 상피 세포 인구는 쉽게 휘황 태그 경우 adenoviral 구조가 사용되는 표준 형광 현미경 방법을 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 조직 재조합 방법은 현재 유전자 변형 동물의 생성을 필요로하지 않습니다 복잡한 3D 조직 구조 내에서 야생 형 또는 돌연변이 벡터와 상피 세포의 transfection을위한 가장 효과적이고 접근 방법입니다.

Protocol

프로토콜은 그림 1에 설명 된 네 개의 주요 단계가 포함되어 있습니다. 모든 단계는 전체 자세히 설명되어 있습니다. 아데노 바이러스 건설 바이러스 정화는 해부하는 상피 초보의 유전 형질 도입에 사용하기 위해 장기 수확을 사전에 수행해야합니다. adenoviruses과 함께 작업 할 때 모든 표준 BSL-2 안전 조치를 준수해야합니다.

1. 마우스 배아 턱밑 분비선 (SMG) 수확 및 Microdissection

1. 배아 일 13시 마우스 배아의 자궁 전위와 수확 문자열 (E13, 3-5 상피 꽃 봉오리) 기관 IACUC의 승인을 다음 절차에 이어 CO ₂ 마취법을 사용하여 시간 제한이 초과 임신 여성 마우스 (outbred 변형 CD-1 또는 ICR)을 안락사시켜야 위원회. 질 플러그 발견의 날은 E0로 지정되어 있습니다. 갈라진 틈은 단지 시작과 하나의 주요 꽃 봉오리와 줄기가있을 때 침샘도 E12 단계에서 수확하고 배양 할 수 있습니다시작합니다. 이전 단계에 SMGs 여기에 표시된 것보다 다른 문화 조건을 필요로합니다.
2. 페놀 레드 (생명 기술), 100 U / ML 페니실린과 보충, 100 μg / ML의 스트렙토 마이신 (펜 패 혈성이 부족한 DMEM....

Results

주요 실험 단계의 흐름은 그림 1에 설명되어 있습니다. 그대로 SMG 고립 된 상피 흔적 기관 및 해당 mesenchyme의 예는 그림 2에 표시됩니다. 지정된 시간에 대한 양식 예를 생체가 그림 3에 표시됩니다 때 morphogenesis을 분기 받아야 계속 재결합 SMGs의 Brightfield 이미지. 상피 GFP를 표현하는 48 시간에 성장 재결합 분비가 그림 4에 표시됩니다. 재결합 SMGs의 공 촛점 이미지는 고정 및 이미징 immunocytochemistry 다음 문화의 72 시간 후, 그림 5에 표시됩니다. 상피 마커, E-cadherin은 주변 mesenchyme에서​​ GFP-표현 상피 세포 인구를 demarcates. 상피의 주변에서 지역화 지하 막 단백질, perlecan의 검색은 재결합 분비의 지하 막 중 적.......

Discussion

예 생체 상피 - 중간 엽 재조합 기술이 처음 1981 ¹⁶ 턱밑 침샘에 출판되었다. 이 프로토콜에서는, 우리는 재결합 선의 컨텍스트 내에서 상피 세포의 유전자 발현을 조작하는 adenoviral 감염를 사용하여 원래의 방법에 따라 확장합니다. 우리는 감염된 세포의 비율은 바이러스 발기인의 속성, 바이러스 titer 및 바이러스 순도에 따라 달라집니다 반면, 상피 세포의 비율은, 아데노 바이러스에 감염되어 있는지 보여줍니다. 우리는 효율적으로 상피 도입, 여기에 설명되지 않은의 정화를 위해 CsCl 기울기 - 정화 바이러스를 사용하는 데 필요한 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 이전에 재결합 (데이터 미도시)에 mesenchyme 세포를 감염 할 수 있었던 때문에, 중간 엽 인구의 독립적 인 유전자 조작도 가능합니다. 우리는 최근 역할을 식별하는 데이 adenoviral transfection / 조직 재조합 방법을 사용극성 단백질, PAR-1B를 들어, 침샘을 개발 상피의 지하 막의 위치의.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
페놀 레드가없는 DMEM / 햄의 F12 중	생명 기술	21041-025
페니실린과 스트렙토 마이신	생명 기술	15070-163	10X 주식
Dispase	생명 기술	17105-041	단일 사용 aliquots을 고정에서-20C
BSA	시그마	A2934-100G	분수 V, 낮은 내 독소
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	높은 titer (1x10 10 PFU / ML) 여야합니다. CsCl 정화 바이러스는이 분석에서 바이러스를 열 정화보다 더 효과적입니다.
16 % Paraformaldehyde	전자 현미경 과학	15,710	5 %의 자당 (w / V)와 PBS에서 2 %로 희석
1X 인산 버퍼 생리 (PBS)	생명 기술	70011-044	10X 혈통 준비
행크의 균형 소금 솔루션	생명 기술	14175095	더 칼슘도없고, 마그네슘, 아니 페놀 레드
트랜스페린	시그마	T8158	25 MG / DMEM/F12 미디어 ML 주식 솔루션입니다. 단일 사용 aliquots에서-20C를 고정
L-아스코르브 산 (비타민 C)	시그마	A4403	DMEM/F12 media.Freeze 단일 사용 aliquots 75 MG / ML 주식 솔루션에서-20C
			표 1. 재결합 프로토콜을 SMG에 필요한 시약의 목록입니다.
10cm 멸균 플라스틱 요리	코닝	430167	비 조직 문화 치료 접시도 사용할 수 있습니다.
전송 라이트 기반으로 스테레오 해부 현미경	니콘	SMZ645	현미경을 해부 모든 스테레오가 전송 가벼운 기지를 가지고 사용할 수 있습니다.
35mm 조직 문화 요리	매	353001	비 조직 문화 치료 접시도 사용할 수 있습니다.
50mm 직경 microwell 요리	MatTek 공사	P50-G-1.5 14F
Nuclepore 트랙 - 에칭 막 필터	워트 먼지	110405	13mm 직경, 0.1 mm 구멍 크기
Widefield 형광 현미경	칼 Zeiss, USA	Axio 옵저버 Z1	모든 형광 현미경 (똑바로, 전) nverted 또는 현미경을 해부 스테레오는 첨부 된 디지털 카메라로 낮은 배율에서 GFP 발현을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.
공 촛점 현미경	Leica 마이크로 시스템즈	TCS SP5	공 촛점 현미경 자세한 세포 구조를 볼 필요가 있습니다. 모든 공 촛점 현미경을 사용하실 수 있습니다.
시간 제한이 초과 임신 여성 마우스, 스트레인 CD-1 또는 ICR	찰스 강 (Charles River) 연구소		태아는 하루에 13 일 (일 0로 지정 플러그 발견 하루)에 수확하고 있습니다.
메스 블레이드 # 11	정밀 과학 도구	10011-00
메스 핸들 # 3	정밀 과학 도구	10003-12
뒤몽 # 5 포셉 inox 합금, 0.05mm X 0.02mm	정밀 과학 도구	11252-20	배아에서 분비 수확에 이상적
뒤몽 # 5 포셉 dumostar 합금, 0.05mm X 0.01mm	정밀 과학 도구	11295-20	좋은 팁 상피에서 mesenchyme을 제거 필요합니다. 텅스텐 바늘도 사용하실 수 있습니다.
			표 2. 장비 재결합 프로토콜을 SMG에 사용됩니다.