3D 원자력기구의 변화를 공부하기 위해 3D 보존 된 계면 핵에 결합 Immunofluorescence와 DNA의 물고기

요약

여기 3D 현미경 및 분석 (3D immuno-DNA의 물고기)에 의해 다음 DNA 생선의 immunofluorescence와 DNA 시퀀스에 의한 히스톤 수정의 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.

초록

3D 공 촛점 현미경에 이어 3 치수 보존 핵에 DNA 프로브를 사용하여 원위치 하이브리드 화에 형광은 (3 차원 DNA 물고기) 각 셀의 하위 지역 염색체 유전자 loci의 위치, 또는 전체 지역을 시각화 할 수있는 가장 직접적인 방법을 나타냅니다. 분석이 유형의 핵의 글로벌 아키텍처뿐만 아니라 핵 공간 내의 특정 게놈의 loci와 지역의 행동에 대한 통찰력을 제공합니다. Immunofluorescence는 반면에, 핵 단백질의 검출을 (수정 histones, 히스톤 변형과 수식, 전사 기계 요소, 핵 하위 구획 등) 할 수 있습니다. immunofluorescence 및 3D DNA 물고기를 결합의 주요 과제는 핵의 3D 아키텍처뿐만 아니라 항체에 의해 검출 된 에피토프를 유지하기 위해 한 손에 있으며, 반면에, DNA 프로브의 침투가 감지 할 수 있도록 유전자 loci 또는 염색체 지역 ^1-5. 여기 3D 보존 핵의 게놈 loci과 염색질 수정 시각화를 결합한 프로토콜을 제공합니다.

서론

Epigenetic 메커니즘을 트리거 설치 및 발달 및 세포 유형의 특정 전사의 프로필 상속. 한 수준에서이 활성 또는 자동 게놈 영역을 정의 염색질 포장 변조를 포함합니다. 큰 규모에서 게놈과 핵 건축의 글로벌 3D 조직은 전사 패턴의 제어 역할을한다. 따라서, 이러한 epigenomic 기능의 해부는 유전자 ^6-11을 규제하는 방법의 전체 이해 필수적입니다.

결합 immunofluorescence 및 3D DNA의 물고기는 특정 상호 작용 / 핵 내에서 DNA 시퀀스 및 / 또는 단백질의 연결을 평가하여 분자 및 생화학 분석을 보완 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 동안 또한, 같은 염색질 immunoprecipitation (칩 seq) 또는 깊은 시퀀싱와 결합 염색체 캡쳐 형태로 게놈 전체의 높은 처리량 기술 (4C-seq, 5C는, 하이-C) 글로벌 DAT를 제공합니다세포 인구 ^12, immunofluorescence / DNA 물고기 기술은 단일 세포 수준에서 분석 할 수 있습니다.

여기 3D 현미경 및 분석 (3D immuno - 물고기) 다음 DNA 생선의 immunofluorescence와 DNA 시퀀스에 의한 히스톤 수정의 동시....

프로토콜

1. Fluorophores있는 DNA 프로브 레이블 : 닉 번역 (~ 6 시​​간)

1. 클린 BAC DNA (맥시 사립으로 작성) 또는 plasmids 또는 PCR 제품, H ₂ O에 resuspended 모두, 라벨에 사용할 수 있습니다. 참고 강력한 생선 신호, 프로브 적어도 10킬로바이트에 걸쳐해야.
2. RNase에서 DNA를 배양 37 번 30 분에 대한 ° C (모든 시약은 표 1에 나열되어 있습니다).
3. 16에서 2 시간의 대화명 번역 반응을 길러 ° C (표 2, 3 참조). 직접 라벨의 다른 방법은 (: 생선 태그, Invitrogen 예) 사용할 수 있습니다.
4. -80에 하나의 시간에 대한 반응을 비활성화 -20 ° C.에서 ° C 또는 특급
5. 2 % 아가로 오스 겔에서 프로브의 크기를 결정합니다. 얼룩은 약 300-500 BP (Cy5-프로브의 비방이 표시되지합니다)에서 대부분의과 100 1,000 BP 사이 여야합니다. DNA가 충분히 소화되지 않은 경우, 더 많은 DNA 폴 I 및DNase I은 반응에 추가 및 16 ° C.에서 두 시간에 incuba....

결과

DNA와 immuno-생선은 B와 T 림프구 개발하는 동안 항원 수용체 loci의 V (D) J 재조합의 과정과 관련된 핵 조직의 변화를 연구하기 위해 Skok 실험실에 사용됩니다. 위에 설명 된 기법은) 우리는 전 현장의 두 끝 (수축) 사이) 측정 거리에 ii) 대립 유전자 또는 loci (페어링) 사이를 측정 거리, III)가, loci에서 IV를 발생하는 DNA 손상을 분석 가능하게 대립 유전자의 위치를​​ 평가 및 하위 구획 (우리의 연구에서 억압 pericentromeric heterochromatin) 핵에 상대적으로, 그리고 V loci)는 대립 유전자와 loci (우리의 연구에서 phosphorylated 히스톤 γ-H2AX 협회)에 핵 단백질의 연결을 신고 할 수 있습니다. 특히, 우리는 B 세포 ^17-30을 개발 면역 글로불린 loci의 V (D) J 재조합의 규정에 현장 역학의 역할을 분석하고, CD4 사이의 계보 (Lineage) 헌신의 규정에 ^+와.......

토론

위에 설명 된 기술은 림프구에게 ^{30,31 개발에} 면역 글로불린 및 Tcra / D loci의 V (D) J 재조합의 규정을 분석하기 위해 실험실에서 사용되었습니다. 우리는이 기술이 다른 세포 유형의 다양한 핵 단백질, 핵 구획과 loci의 감지,에 적응 될 수 있다는 확신합니다. 프로토콜의 수정이 필요할 수 있습니다,이 경우에 초점을 주요 단계는 다음과 같습니다. 첫째, permeabilization의 길이는 세포 종류에 따라 조정할 수 있습니다. 기본 항체 부화의 두 번째 길이는 또한 항체의 품질과 관심의 단백질 (예를 들어 경우에, 부화은 4 ° C에서 밤새 수행 할 수 있습니다)의 풍부한에 따라 조정할 수 있습니다. 중요한 것은 변성 단계를 적용 할 수 있으며, HCL 치료는 DNA 물고기 ²⁰ 포름 아미드 ^3,4,34와 NaOH의 변성에 의해 대체 될 수 있습니다. 또한 반복액체 질소의 에드 냉동 해동 사이클은 고정 / 혼자 <.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약 / 재료의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
H 2 O	어부	# BP2470
RNase	시그마	# R4642
dNTP	시그마	# DNTP100
알렉사 dUTP	Invitrogen	# C11397에 대한 C-11401
Cy3 또는 Cy5 dUTP	어부	# 45-001-XXX
DNase I	로슈	# 04536282001
DNA 폴 I	Biolabs	# M0209
0.025 μm 필터	Millipor전자	# VSWP02500
침대-1 DNA 1 MG / ML	Invitrogen	# 18440
Hybloc DNA 1 MG / ML	응용 유전학	# MHB
연어 정자	시그마	# D1626	분말은 H 2 O에 10 밀리그램 / ML에 resuspended 할
NaAc (나트륨 아세테이트, 산도 5.2 완충 용액)	시그마	# S7899
Ficoll 400 (몰 Biol 학년)	어부	# 525
Polyvinylpyrrolidone (몰 Biol 학년)	어부	# BP431
Dextran 황산 분말	시그마	# D8906
SSPE (식염 - 나트륨 인산-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 20x 솔루션	어부	# BP1328
포름 아미드	어부	# BP227
Coverslips	어부	# 12-548-B
슬라이드	어부	# 12-550
6 - 잘 접시	어부	# 0720080
10X PBS,	어부	# MT-46-013-CM
폴리-L-라이신 솔루션	시그마	# P8920
Paraformaldehyde, prills, 95 %	시그마	# 441244
트리톤-X-100, 몰 Biol 학년	시그마	# T8787
BSA (소 혈청 알부민) 분수 V	어부	# BP 1600
일반 염소 혈청	벡터 연구소	# S-1000
십대 초반 - 2​​0 몰 Biol 학년	시그마	# P9416
SSC (식염 나트륨 시트르산) 20x 솔루션	어부	# BP1325
골드 antifade 시약을 연장	Invitrogen	# P36930
DAPI (4 ', 6 diamidino-2-phenylindole)	시그마	# D9542
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