유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

요약

우리는 안티 - 암 치료에 영상 응답하는 방법을 설명 생체 내 및 단일 셀 해상도.

초록

종양 microenvironment는 종양 개시, 진행, 전이, 그리고 안티 - 암 치료에 대한 반응에 중추적 인 역할을 담당하고 있습니다. 입체 공동 문화 시스템은 자주 약물 반응에서의 역할 등의 종양 - 기질 상호 작용을 설명하다하는 데 사용됩니다. 그러나, 손상 microenvironment의 생체에서 발생하는 상호 작용의 많은 완전히 체외 설정에서 이러한 복제 할 수 없습니다. 따라서, 실시간으로 해당 프로세스를 직접 시각화 요법에 종양 반응을 이해하고 암 세포 이러한 반응에 영향을 미칠 수있는 기질 사이의 상호 작용을 식별하는 중요한 도구로 자리 잡았습니다. 여기에 직접 약물 배포, 암 세포 반응과 유방암 모델에서 전신 치료의 관리에 따라 종양 - 기질 상호 작용의 변화를 관찰 할 라이브, anesthetized 마우스 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용하는 방법을 제공합니다. 우리는 labeli위한 절차를 설명NG 다른 종양 부품, 치료 반응을 관찰을위한 동물의 치료, 40 시간 영상에 대한 종양 조직을 노출하기위한 수술. 이 프로토콜에서 얻은 결과는 약물 침투, 암 세포의 죽음과 stromal 세포 마이그레이션과 같은 프로세스가 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 평가 될 수있는 시간 경과 영화입니다.

서론

종양이 성장 ¹ 적절한 환경을 유지하는 데 도움이 암 세포와 stromal 성분 (세포와 비 휴대폰 모두) : 고체 종양은 두 가지 주요 격실로 구성되어 있습니다. 이 stromal 성분은 유방 ^2-5의 일정을 포함 암의 많은 종류의 개발, 진행 및 전이에 중요한 역할을 재생합니다. stromal 환경은 또한 치료 반응 할 ^{2,4,5 영향을 미칩니다.} 따라서, 암 세포가 손상 microenvironment의 컨텍스트 내에서 기존과 소설 치료에 응답 방법을 결정하는 것은 암 생물학에 대한 우리의 이해를 발전 및 현재 치료 전략 개선을위한 중요합니다. 또한, 암 세포 기질의 상호 작용은 치료의 관리에 따라 변경하는 방법 정의하는 것은 종양 재발의 생물학을 이해하는 데 중요합니다.

Organotypic 공동 배양 시스템은 종양 - 기질 상호 작용을 연구하는 데 유용되었습니다 까지하지만, 현재 사용할 수있는 방법을 성공적으로 면역 세포의 혈관 기능 및 채용에 대하여 특히 체외에서 그대로 종양의 microenvironment를 요점을 되풀이 할 수 분명하다. 사실, 체외에서 관찰 요법으로 암 세포 응답은 종종 microenvironment ⁵ 그대로 생체에서 관찰 것과 크게 다릅니다. 따라서, 치료 반응에 종양이 - 기질 상호 작용하고 영향을 공부 생체 모델에 더 나은 임상 적으로 관련성이 높은 메커니즘에게 ⁷ 반영 될 수 있습니다.

생체의 항 암 치료에 반응을 연구의 주요 수단은 종양 크기와 처리 동물이나 환자에서 파생 된 조직의 조직 학적 평가의 측정을 겪었습니다. 그러나 지난 20 년 동안 현미경과 형광 기자의 진보는 간 및 세포 내 프로세스의 시각화을 사용하도록 설정 한라이브, anesthetized 동물의 고해상도 (intravital 영상) ^8시. 이 intravital 현미경 기술은 spatially과 시간적 셀룰러 및 하위 세포의 해상도 ^8,9에서 종양 - 기질 상호 작용의 생체 역학에을 해부 특히 도움이 될 입증되었습니다.

intravital 이미징에 의해를 풀 된 프로세스 안티 종양 T 세포의 세포 독성 ^10,11, T 세포와 골수 양 세포 ¹² 사이의 상호 작용, 치료 치료 ¹³ 대 식세포에 의존 암 세포 intravasation 및 전이에 따라 콜라겐 성분과 조직의 변화의 역학을 포함 ¹⁴ 및 혈관 투과성 ^15.

intravital 이미지에 대한 세 가지 주요 요구 사항이 있습니다. 다음은 적절한 준비와 노출 조직의 이미징, 관심의 조직 구성 요소의 형광 라벨을위한, 그리고 페어 현미경 카메라을 포함이미지 ^16을 획득 할 수 ystem. 이러한 요구 사항을 해결하는 데 사용되는 가장 일반적인 전략은 다음과 같습니다 : 1) heterotopic 준비 (예 : 귀 및 눈 궤도의 접종), 영구적 인 이미지 창 또는 exteriorized 준비 (예를 들어, 등쪽 피부 플랩), 2) 유전자 변형 형광 기자입니다.. 형광 injectables는 조직 구성 요소에 라벨을 지정하기 위해, 그리고 3) multiphoton 또는 공 촛점 현미경 시스템은 각각 ⁹ 광전자 증 튜브 또는 전하 결합 소자 (CCD) 카메라,와 페어링. 우리는 형광 기자 인코딩 transgenes을 표현 anesthetized 동물 이미징의 사타구니 유선 노출 할 수있는 수술 준비 피부 플랩 모델을 사용합니다. 이미지는 4 레이저 회전 디스크 공 촛점 현미경 시스템 ^17와 짝을 강화 CCD (ICCD) 카메라를 사용하여 12~40시간 기간 동안 얻을 수 있습니다. 이러한 방식으로 이미징은 우리가 생체 의약품 유통, 단계에 따라 달라 채널에서 같은 과정을 연구 할 수있다emotherapeutic 반응, 화학 요법 유도 된 세포의 죽음, 그리고 골수 양 세포의 행동 ⁵ 종류.

우리는 항암제 치료, 유방암의 마우스 모델에서 종양 - 기질 상호 작용에 암 세포 응답의 intravital 이미징을위한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 하나의 이미지 세션 40 시간까지의 기간에 대한 유전자 변형과 이식 두 가지 모델에서 유전자 변형과 injectable 형광 라벨의 다양한 다양한 암 세포와 stromal 구성 요소를 모두의 행동과 죽음을 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

설명 모든 절차는 지역 기관 동물 케어 및 사용위원회의 사전 승인을 포함한 척추 동물의 사용에 대한 지침 및 규정에 따라 수행해야합니다.

1. 이미징 (트렌스 제닉 또는 Orthotopic)을 마우스 유방 종양을 생성하는

1. 유전 공학 마우스 모델을 사용하여 이미지를위한 유방 종양을 생성 (예 : 마우스 유방 종양 바이러스 긴 터미널 반복 [MMTV]-polyoma 중간 T 항원 [PyMT] 또는 SV40의 쥐 C3 (1) 발기인 구동 대형 T 항원 (태그) [C3 ( 1) 태그] 모델) 또는 orthotopic 이식 모델 (syngeneic, allogeneic, 또는 xenogeneic).
2. 유전자 변형 기자 라인 (예 : ACTB-ECFP) 또는 주요 암 세포 나 이식 다음 세포 라인 (예 도입)의 전 생체 조작을 사용과 유전자 변형 모델을 횡단하여 레이블 암 세포합니다. orthotopic 이식, s의 샘플 프로토콜에 대한EE ^18.

2. 종양 Microenvironment 또는 하위 세포 구성 요소의 시각화 구성 요소

1. 유전자 변형 레이블을 사용하여 종양이 구성 요소를 시각화. 유전자 변형 기자 마우스 (예 : C-FMS-EGFP 핵에 대한 골수 양 세포 나 ACTB-H2B-EGFP의 경우) 또는 이식, 라벨 조직을받는 등 쥐를 이용하여 유전 공학 종양 모델을 이종 교배하다. 이 각각 치료 또는 셀 사망과 관련된 핵 변화에 대응하여 암 세포 stromal 세포의 상호 작용 시각화 할 수 있습니다.
2. injectables를 사용하여 microenvironment를 시각화. 대리인의 다양한 종류 (예 : 휘황 표시 항체 또는 화학 염료) 종양의 다양한 구성 요소에 라벨을 사용할 수 있습니다. 염료의 반 생명과 하나 추적에 관심을 응답에 따라 injectable은 영상의 시작에 앞서 실시 할 수 있습니다 또는 이미지 세션 intravenously (IV.) 또는 정수 중raperitoneally (IP., 그림 1).

3. 현미경 및 이미징 소프트웨어

1. 현미경. 현미경 시스템 및 소프트웨어의 다양한 라이브 마우스의 이미지에 사용될 수 있습니다. 가장 일반적으로 사용되는 시스템은 공 촛점 또는 multiphoton 현미경입니다. 우리는 ICCD 카메라 (XR-메가 10EX S-30, 스탠포드 포토닉스, 팔로 알토 (Palo Alto), CA)와 마이크로 lensed 회전 디스크 공 촛점 현미경 (Solamere 기술, 솔트 레이크 시티 (Salt Lake City), UT)을 사용합니다.
2. 이미징 소프트웨어. 우리는 오픈 소스 소프트웨어 μManager (베일 연구소, 캘리포니아 대학, 샌프란시스코 [UCSF])을 사용합니다.
3. 이미지 분석. 우리는 이미지 분석을 위해 Imaris (Bitplane), Volocity (PerkinElmer) 및 ImageJ (건강 [NIH]의 국립 연구소)을 사용합니다.

4. 이미징을위한 동물의 (사전) 치료

1. 사타구니 유방 종양이 가장 긴 직경 캘리퍼스 measur 약 8mm 이하를 측정 때 우리 프로토콜을 사용하여 이미지에 적합합니다장담.
2. 실험에 필요한 같은 작은 분자 억제제 치료, 항체 또는 chemotherapeutic 약물로 치료 이미징 동물의 경우 영상 중에 이전 또는 치료를 시작합니다. 영상은 (영화 1, 2) 시작 된 후 chemotherapeutic 약물 doxorubicin에 의해 유도 세포 사망의 영상이 가장 (영화 세 이미징 24 시간을 시작하여 이상이 약물 치료 후 촬영하는 동안 예를 들어, 마약 넘쳐 흐름 및 유통의 영상은, 관리가 필요합니다 및 4).

5. 이미징 동안 동물의 하이드와 피 Osmolarity을 유지하는 식염의 작성

1. 1 ML의 주사기에 1X PBS의 약 1 ML을 그립니다. Propidium의 요오드화물은 (PI, Invitrogen, 1 MG / ML, 희석 1:15) 정기적으로 이미징 세션 동안 (IP). 실시 될 것입니다이 솔루션에 추가 할 수 있습니다. 이 투과성 세포 멤브레인이 죽었거나 죽어 세포의 핵의 이미지를 허용합니다. PI는 매우 짧은 HAL이vasculature의 F-삶과 따라서 이미징 세션에 걸쳐 다시 실시해야합니다.
2. 이 주사기에 날개 주입 세트 (23 게이지, ¾ 인치 바늘, 12 인치 튜브) 첨부 생리 식염수가 종료 한 방울까지 튜브를 통해 솔루션을 밀어 튜브의 끝 부분에 바늘 끝.
3. 주입 세트, 그리고 적절한 생리 식염수로 충전을에서 주사기를 제거합니다.
4. 라인에 거품을 소개하지 돌보는, 주입 세트에 주사기를 다시 연결합니다.

6. Isoflurane 마취 시스템의 준비

1. 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요에 물을 추가하고 장소에를 나사. 이것은 동물에 전달 가스를 ...을 축이다 폐의 자극을 방지하고 장기 마취하에 동물의 생존을 연장합니다.
2. 상단 줄에 isoflurane 탱크를 채우십시오. 주의 : Isoflurane은 또한 연구에 영향을 미칠 수있는 강력한 마취제이다. 적절한 진공 시스템은 B해야초과 가스 영역에서 제거되는 것을 보장하기 위해 장소에서 5.
3. 산소 탱크와 질소 탱크 모두의 전원을 켜고 흐름을 조정합니다. 산소 0.2 L / 분 (~ 21 %) 주위에 있어야 반면 질소는 약 1.0 L / 분에 있어야합니다.
4. (자체) 진공을 켭니다. 진공은 1.2 L / 분에 대해해야합니다.
5. 유도 챔버에 마취 라인이 열려 있는지 확인하고, 수술 영역으로 라인과 현미경은 실행 종료와 함께 해제된다.
6. 마취 시스템에 부착 된 라텍스 호흡 가방이 비정상적으로 증가되었는지 확인합니다. 가방이 급증하지 않는 경우를 대체합니다.
7. 현미경 단계와 수술 플랫폼에 마취를 전달하는 코 콘의 각에있는 고무 다이어프램을 확인합니다. 고무가 얇은를 시작하는 경우를 대체합니다.

7. 수술 도구, 외과 플랫폼의 작성

1. 뜨거운 비드 살균기를 켜고하고> 200 ° C.에 도달하게
2. 비누와 물에 수술 도구를 씻어(한 포셉 한 쌍의 [바람직 이빨]와 동물의 피부를 통하여 절삭 가위, 집게 한 쌍의 [바람직 톱니 모양]와 종양의 추가 노출 가위).
3. 뜨거운 비드 살균기를 (또는 수술 도구를 사전에 autoclaved 할 수 있습니다)를 사용하여 최소 30 초 동안 수술 도구를 멸균.
4. 살균 도구를 오염을 막기 위해 확인하는 동안 수술 도구를 식혀 보자.
5. 스티로폼 배송 냉각기에 뚜껑을 수집합니다. 이렇게하면 수술 플랫폼 될 것입니다.
6. 스티로폼 뚜껑의 상단 (충분히 충당하기 위해)에 실험실 담그는 조각을 놓으십시오.
7. 접사 실험실 테이프 실험실 담그는 (1 마취 시스템 라인 코 콘 "테이프가 최선을 작동). 18 G 1 개 ½ 삽입 '유지하는 코 콘의 양쪽에 스티로폼 뚜껑에 테이프를 통해 바늘을 코 콘이 곳에서 확보.
8. betadine, 멸균 거즈, 두 70% 이소프로판올 잎사귀, 현미경을 따로 설정실험실 테이프 슬라이드, Krazy 아교, 4 조각 (½ "폭).

8. 현미경의 작성

1. 현미경, 카메라, 현미경을 실행하는 컴퓨터를 켭니다.
2. 난방 담요를 켜십시오.
3. 역 현미경이 사용되는 경우, 주문 제작 단계 삽입은 사타구니 유방 땀샘의 위치에 해당하는 이미지 포트로 디자인해야합니다. 단계는 비누와 물과 건조에 잘 삽입 청소하십시오. 영상 포트를 통해 커버 유리 (# 1.5 두께)를 확보하고 70% 이소프로판올로 전체 표면을 청소 (½은 "가장 잘 작동합니다) 연구실 테이프를 사용하십시오. 오염을 방지하기 위해 멸균 거즈로 무대를 맡아. 무대에서 무대 삽입을 배치 하고 건조를 방송 할 수 있습니다.
4. 실험실 테이프 4 ~ 6 조각 (1 "폭)를 찢어, 약 6 길이 인치는 현미경의 측면에 첨부. 테이프의이 조각은 동물의 코 콘 제공 마취를 배치하는 데 사용됩니다D 그 곳에서 해보세요.
5. 길이 인치 약 테이프 두 조각 (½ 인치 폭)를 찢어. 이러한 마우스와 장소에 종양을 노출하는 데 사용되는 현미경 슬라이드에 PBS를 제공 나비 바늘을 유지하는 데 사용됩니다.

9. 영상의 사타구니 유선을 노출

1. 캐리어 가스로 21 % 산소와 균형 질소 (약 1.0 L / 분의 유량)과 isoflurane 4 % 사용하여 유도 챔버에서 동물을 마취. 이 2-4 분 정도 소요됩니다.
2. 그가 직면하고있는 복부 표면과 깊이 천천히 호흡되면 수술 플랫폼에 마우스를 전송합니다. 수술 플랫폼에 마취 라인을 열고 다음 마취 시스템에 너무 높은 압력을 피하기 위해이 순서에 유도 챔버에 마취 라인을 닫습니다. 현재 4 %에서 2.5 %로 isoflurane의 농도를 줄일 수 있습니다.
3. 동물이 충분히 anes 있는지 확인 반사 페달 철수를 확인노상 강도 핀치를 수행하여 수술에 대한 thetized. 가 노상 강도 핀치에 (예를 들면 트 또는 꼬리를 곱슬 곱슬하게) 반응하지 않는 경우 동물은 충분히 anesthetized 있습니다. 동물이 노상 강도 핀치에 반응 않는 경우, isoflurane의 농도를 증가시킵니다.
4. 실험실 테이프 수술 플랫폼 (½ "테이프이 가장 적합한)로 마우스의 사지를 고정합니다.
5. 동물이 수술 플랫폼에 고정되면 (옵션), 헤어는 전자 면도기를 사용하여 복부 표면에서 제거 할 수 있습니다. 화학 머리 제거를 선호하는 경우, 이것은 수술하기 전에 24-48 시간을 수행해야합니다. 빠진 머리카락이 강하고 급성 면역 반응을 일으킬 수로 수술하기 전에 머리를 제거하면, 이미징 사이트의 오염을 방지하는 데 도움이됩니다.
6. 70% 이소프로판올 잎사귀와 betadine과 동물의 복부 표면을 소독.
7. 멸균 가위와 집게 (치아)의 첫 번째 쌍을 사용하여 피하 복부 중간 선 절개를그 요도 위 ~ 3mm의 칼 돌기로 실행됩니다. 펑 쳐링 또는 복막을 통해 절단 방지하기 위해주의를 기울여.
8. 멸균 가위와 집게의 두 번째 쌍을 사용하면 (톱니 모양), 부드럽게 복막 캐비티에서 첨부 된 사타구니 유선과 피부를 분리합니다.
9. 유리 현미경 슬라이드를 타고 이전 단계에서 생성 된 피부 플랩에 대해 그것을 배치. 마우스가 무대에 배치되면 종양의 일괄 평면 앉아 것이고, 두 다리의 움직임을 방해하지 않는 방식으로 슬라이드를 배치합니다.
10. 현미경 슬라이드가 제대로 위치되면 superglue (예를 들면., Krazy 접착제)를 사용하여 피부의 외부 표면에 슬라이드를 첨부합니다.

10. 스테이지에서 마우스를 위치

1. 수술 플랫폼 동물의 팔다리를 보호하는 실험실 테이프를 제거합니다.
2. 현미경 단계에 마취 라인을 열고 anesthe를 닫습니다이 순서 외과 플랫폼에 SIA 라인.
3. 빠르게 현미경 단계에 동물을 전송합니다.
4. 동물이 위치를 전송하고 마취 라인과 마우스 anesthetized 유지 및 편안한 위치에 있도록 제대로 코 콘 (예를 들면 실험실 테이프를 사용) 확보되면.
5. 이 상단에 있으며 현미경 단계에있는 커버 유리로 덮인 영상 포트 중 하나의 중앙에 위치하도록 종양을 쉽게받을 수 있습니다.
6. 접안 렌즈 사용하여 종양이 올바르게 위치, 그리고 부드럽게 테이프 현미경 슬라이드 다운되어 있는지 확인합니다. 조직에 혈액의 흐름이 가려지지 않도록 슬라이드가 느슨하게 확보해야합니다. 현미경 슬라이드를 녹음하면 동물의 호흡에 의해 도입 이미징 유물을 최소화하는 데 도움이됩니다.
7. 날개 달린 주입은 # 5에서 준비 무균 1X PBS 나 호수가 (선택적 등 PI로 염색을 포함)이 포함 된 1 ML 주사기에 부착 된 세트로 내주하시는 intraperitoneal 라인을 삽입합니다. Inj100 μl의 IP와 동물 요법. 선이 삽입됩니다. 이 시점에서 영상 세션이 끝날 때까지 1 시간 간격 (또는 PI과 염분의 25 μl 매 30 분)에서 염분의 50 μl로 동물을 주입.
8. 동물의 생체 신호를 모니터링하려면 (스타 생명 과학 주식회사의 예 MouseOx 시스템) ¹⁹ 산소 농도계 프로브를 연결합니다.
9. 저체온증을 방지하기 위해 난방 담요로 마우스를 다룹니다.

11. 이미지의 취득

오픈 소스 소프트웨어 μManager (베일 연구소, UCSF)는 시간 경과 이미지를 획득하는 데 사용됩니다. 원시 데이터는 Imaris (Bitplane) 소프트웨어에 컴파일하고, (예를 들면 Volocity [PerkinElmer] 또는 ImageJ [NIH]) 독립적 인 관찰자에 의해 수동으로 채점, 또는 Imaris 또는 기타 이미지 분석 소프트웨어에서 분석 할 수 있습니다.

12. 안락사

이미지 세션 (1-4의 끝에서0 HR은)는 분석 과정의 유형에 따라, 동물은 euthanized 있습니다.

1. isofluorane의 농도는 4 %로 증가된다.
2. 이 호흡을 포착하고 다음 단계에서 제거 후 동물은 30 초까지 관찰합니다.
3. 자궁 경부 전위는 동물이 euthanized되었는지를 수행합니다.

13. 대표 결과

이 종양 치료, 치료 후 세포 죽음과 세포 사망 ^5에 대응 종양 - 기질 상호 작용에 도달하면이 방법을 사용하여 Intravital 영상은 종양, 넘쳐 흐름 및 약물의 분포에 대한 약물 투여 등 다양한 프로세스의 직접적인 시각화 할 수 있습니다. 이미지가 획득하는 동안 종양 조직에 넘쳐 흐름에 따라 종양 및 배포에 대한 약물의 도착을 관찰하기 위해 동물이 주입되어 있습니다. 비록 채널의 여러 클래스emotherapeutics (예 : doxorubicin)을 약하게 형광 있으며, 많은 사람들이 없습니다. 휘황 복합 dextrans는 조직에 약물 전달 및 확산을위한 대리 마커로 사용될 수 있습니다. 그림 2, 영화 1 fluorescein-isothiocyanate (FITC) 복합 IV을 주입 2 MD dextran (Invitrogen, 1 MG / ML 1xPBS)의 도착을 표시합니다. ACTB - ECFP 마우스, MMTV-PyMT의 종양에.

종양에 약물의 도착 후, 조직을 통해 넘쳐 흐름 및 확산은 약물과 마약 유통 ^(5)의 두 혈관 반감기를 결정하기 위해 이미징 할 수 있습니다. 영화 2 IV를 주입 알렉사 형석-647-복합 10 KD dextran (Invitrogen, 1 개 PBS 1 MG / ML)의 넘쳐 흐름 및 배포를 보여줍니다. ACTB - ECFP; 이미징 동안 C-FMS-EGFP 마우스 C3 (1) 태그에. Imaris (Bitplane)의 시간 경과 영화 컴파일을 한 번하고 난 후, 혈관 반감기 및 약물 분포가 정량화되어 있습니다. 혈관 반감기를 측정하려면각 시점에서 종양 혈관의 평균 형광 강도 계산 및 시간에 대해 도시된다. 약물 분포는 약물에 대한 긍정적 총 종양이 지역 당 %의 지역으로 정량화되어 있습니다.

종양에 약물 전달의 동력학을 추적하는 것 외에, 종양 치료에 반응하는 방법을 결정하는 빈도 것이 중요합니다. 안티 - 암 치료는 세포 죽음을 유도 할 것으로 예상됨에 따라, propidium의 요오드화물 (PI) 염색 또는 구조 핵 변경 사항은 약물 유발 세포 죽음 ^(5)의 마커로 사용하실 수 있습니다. 그림 3은 MMTV의 세포 독성 chemotherapeutic doxorubicin에 대한 종양 반응을 보여줍니다 - PyMT, ACTB - ECFP, C-FMS-EGFP 마우스. 이 세 유전자 변형 MMTV-PyMT, ACTB - ECFP, C-FMS-EGFP 동물, ECFP 라벨 유방암 세포 (파란색), 그리고 EGFP 라벨 골​​수 양 세포 (녹색). 영상이 시작하고 PI는 t에 걸쳐 IP를 전달되기 전에이 세션 동안 이미징 동물은 doxorubicin 18 시간을 투여했다그 위에서 설명한대로 이미지 세션. 암 세포 (ACTB-ECFP 라벨)는 같은 파란색으로 표시되며, 죽었거나 죽어 전지는 빨간색 (PI의 착색)로 나타납니다. 여기에 제시된 시간 시리즈는 시간이 지남에 doxorubicin에 따라 달라 세포 죽음을 유도 보여줍니다. 종양의 세포 죽음의 유도를 정할, 약물 분포를 결정하기 위해 사용되는 분석의 동일한 유형은 양적 출력 PI에 대한 긍정적 총 종양이 지역 당 %의 지역이고, 사용됩니다.

높은 배율의 이미지는 암 세포가 ⁵ 받아야하는 세포 죽음의 유형에 관한 정보를 제공 할 수 있습니다. 영화 3 doxorubicin과 전신 치료에 대한 응답으로 apoptotic 세포 사망의 전형적인 핵 변경 사항을 추적 할 수있는 이미징 실험의 결과를 보여줍니다. 핵을 시각화하기 위해이 세션에서 이미징 동물이 대신 C-FMS-EGFP 기자의 ACTB-H2B-EGFP 기자를 비호, 암 세포의 핵은 녹색으로 표시되도록. 이 MMTV-PyMT, ACTB - ECFP, ACTB-H2B-EGFP 동물은 ADM했습니다inistered doxorubicin (8 1 밀리그램 / kg X PBS) 이전 영화의 시작, 그리고 PI를 (Invitrogen, 1 MG / ML 솔루션 1시 15분을 희석) 포함 1 개 PBS의 시간당 주사를받은에 IP 24 시간. 암 세포의 핵의 구조 변경 사항이 괴사 (핵 형태의 최소한의 변경 사항을 표시 PI-긍정적 세포)를받은 셀 옆에 apoptotic 세포에서 관찰 할 수 있습니다. apoptotic 세포의 핵은 결국 PI의 착색의 이해 (미도시)에 의해 빨간색이됩니다. 괴사 및 apoptotic 이벤트의 수는 PI-긍정적와 핵 형태에 따라 때마다 포인트를 수동으로 정량화되어 있습니다.

화학 요법 유도 된 암 세포의 죽음은 자주 종양 ^2,4,5에 면역 세포의 반응 모집에 결과를 표시합니다. 그림 4는 doxorubicin과 급성 치료에이 stromal 응답의 예를 보여줍니다. MMTV-PyMT, ACTB - ECFP, C-FMS-EGFP 동물이 여기 이미징 doxorubicin (8 1 개 PBS의 MG / kg) IP를 관리 한 . 약 20 시간 전에 이미지의 시작, 시간별 PI 주사의 IP를 받았습니다합니다. 세포 죽음을 시각화하는 실험 기간 동안. 시간은 doxorubicin 치료 후 시간의 수를 나타냅니다 표시하고, 규모 바는 100 μm를 나타냅니다. 이 실험에서 골수 양 세포가 세포 사망의 영역으로 침투와 같은 흰색 화살표로 표시. doxorubicin 관리, 양적 출력 EGFP에 대한 긍정적 총 종양이 지역 당 %의 지역입니다 마약 유통 및 화학 요법에 대한 종양 반응을 결정하는 것은, 사용하는 사용 분석의 동일한 유형에 따라 종양으로 골수 양 세포 침투을 수량화합니다.

화학 요법에 대한 전체 stromal 응답을 시각화뿐만 아니라, 전문 stromal 응답도 ⁵ 시각화 할 수 있습니다. 영화 4 이웃 세포의 괴사 세포 소재의 phagocytosis를 보여줍니다. 붉은 핵 자료는 larg있는 세포에 의해 섭취되는 볼 수 있습니다대 식세포의 전형적인 전자 그대로 녹색 핵. MMTV-PyMT, ACTB - ECFP,이 세션에서 이미징 ACTB-H2B-EGFP 동물은 doxorubicin (1 개 PBS에 8 밀리그램 / kg) IP 관리되었습니다. 영화의 시작하기 전에 24 시간. 동물은 1 개 PBS 포함하는 PI (Invitrogen, 1 MG / ML 솔루션 1시 15분을 희석)의 시간당 주사를 받았습니다. 핵 (ACTB-EGFP 라벨)은 녹색으로 표시하지만, 셀 괴사를 받아야로 붉은십시오.

1 그림. 유전자 변형과 injectable 라벨을 사용하여 다른 종양이 구성 요소의 샘플 라벨이 트리플 유전자 변형 MMTV-PyMT이다;. ACTB - ECFP, C-FMS-EGFP 동물 암 세포가 ECFP과 골수 양 세포의 표현을 통해 파란색으로 표시되는이에 표시된 골수 양 특정 발기인의 EGFP의 표현을 통해 녹색. 동물은 동안 (PI, 빨강, 1X PBS에서 ~ 0.07 MG / ML) propidium의 요오드화물을 주입 한이미징 세션은 세포 죽음을 시각화합니다. PI 라벨 DNA를 만 죽었거나 죽어 세포의 세포 세포막을 교차. 스케일 바 = 100 μm.

그림 2. 종양의 약물 넘쳐 흐름 및 유통이 두 유전자 변형 MMTV-PyMT,. ACTB - ECFP 동물 암 세포가 ECFP의 표현을 통해 파란색으로 표시되는이 방법을 시각화하는 이미징 세션 동안 FITC-복합이 MD dextran (녹색)에 주입 된 약 IV 주사 (파란색) 후 종양에 도달합니다. 영상이 시작되었습니다 후 시간이 표시됩니다. 스케일 바 = 100 μm.

그림 3. 전신 치료 암 세포의 반응. MMTV-PyMT, ACTB - ECFP, C-FMS-EGFP 동물은 chemotherapeutic로 치료이전 이미지에 대한 약물 doxorubicin, 그리고 PI와 함께 주입 (빨강, 1X PBS에서 ~ 0.07 MG / ML)는 세포 죽음을 레이블합니다. 이 이미지 시리즈는 세포 죽음에 다음과 doxorubicin 치료의 유도를 나타내는 시간이 지남에 따라 PI의 착색 (같은 흰색 화살표로 표시)의 축적을 보여줍니다. doxorubicin 치료 후 시간이 시간이 표시됩니다. 이미지는 Z 축에 Z-스택이 포함 된 세 이미지의 최대 강도 계획입니다. 스케일 바 = 100 μm.

4 그림. ACTB - ECFP; MMTV-PyMT의 화학 요법에 골수 양 세포의 반응. 이전 영상에 doxorubicin 20 시간을 투여 C-FMS-EGFP 트리플 유전자 변형 마우스는 동물 시간별 IP를 받았습니다. PI의 주사 (빨강, ~ 1X PBS에 0.​​07 MG / ML) 죽은 세포에 라벨을합니다. 이 이미지 시리즈는 doxorubi에 따라 시간이 지남에 따라 EGFP - 긍정적 인 골수 양 세포 (같은 흰색 화살표로 표시)의 축적을 보여줍니다착 치료. 이 반응 면역 반응은 ^4,5 chemotherapies의 여러 클래스에 대한 치료 반응을 방해 할 수 표시되었습니다. doxorubicin 치료 후 시간이 시간이 표시됩니다. 이미지는 Z 축에 Z-스택이 포함 된 세 이미지의 최대 강도 계획입니다. 스케일 바 = 100 μm.

영화 1. . 암 세포가 ECFP의 표현을 통해 파란색으로 표시되어있는 ACTB-ECFP 동물, 종양에 약물 투여는이 두 유전자 변형 MMTV-PyMT입니다. 동물은 약이 IV 주입 후 종양에 도달하는 시각화하는 이미징 세션 동안 2 MD FITC - dextran 복합 (녹색)을 주입했다. 스케일 바 = 100 μm. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

영화 2. 종양 조직에 약물 침투 트리플 유전자 변형 C3 (1) 태그,. ACTB - ECFP, C-FMS-EGFP 동물 암 세포 LA되는에ECFP와 EGFP의 표현을 통해 녹색으로 표시 골수 양 세포의 표현을 통해 파란색으로 beled 알렉사 형석 647-복합 10 KD dextran (빨간색)와 IV를 주입했다. 보기의 필드는 즉시 dextran을 주입 한 후 표시됩니다. dextran 처음 vasculature가 급속히 종양 조직에 extravasates, 마지막 대 식세포에 의해 이루어집니다 레이블. 스케일 바 = 100 μm. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

영화 3. . ACTB - ECFP; 화학 요법 유도 된 세포 사망 후 핵 변경이 트리플 유전자 변형 MMTV-PyMT의 영상 H2B-EGFP 동물은 이미징 전에 doxorubicin과 함께 주입했다. 로 H2B-EGFP 융합 단백질의 표현에서 추적 원자력 형태 (녹색), 오른쪽 상단 모서리에있는 셀 보는 apoptosis의 전형적인 화학 요법 유도 된 핵 구조적인 변화를 직접 시각화 할 수 있습니다. 동물 rece반 시간별 IP를 ived. 죽어서 죽어 세포를 라벨을 이미지 세션 기간 동안 PI (빨간색)의 주사. 시간은 doxorubicin 치료 24 시간 후 시간 지적했다. 이미지는 높은 배율의 목적 렌즈 (40x, NA 1.1, 물 렌즈)를 사용하여 획득했다. 스케일 바 = 15 μm. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

영화 4. 핵 변화와 화학 요법 유도 된 세포 사망 후 죽은 세포 소재의 호응을 이미징이 트리플 유전자 변형 MMTV-PyMT,. ACTB - ECFP, H2B-EGFP 동물 이미징 이전에 doxorubicin과 함께 주입했다. 로 H2B-EGFP 융합 단백질의 표현에서 추적 원자력 형태 (녹색), 화학 요법 유도 된 핵 구조적인 변화를 직접 시각화 할 수 있습니다. 동물은 절반 시간별 IP를 받았습니다. 죽어서 죽어 세포를 라벨을 이미지 세션 기간 동안 PI (빨간색)의 주사. 이미지 획득했다높은 배율의 목적 렌즈를 (40 X, NA 1.1, 물 렌즈)를 사용하여. 이전 PI와 GFP 신호의 핵 형태와 손실의 변화와 함께 레이블을 지정하는 주요 구조적 변화의 부족은 괴사 같은 세포 죽음을 나타내는 것입니다. 죽은 자료는 대 식세포의 전형적인 대형 핵이있는 세포에 의해 촬영되고 볼 수있다. 시간은 doxorubicin 치료 24 시간 후 시간 지적했다. 스케일 바 = 10 μm. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

토론

생체의 조직 요법에 대한 종양의 반응은 microenvironment의 급성 반응 및 재발 ^5를 동시에 영향을 미치는으로 체외에서 암 세포의 자에게 크게 다를 수있다. 생체의 chemoresistance 경로에 explicating에 가장 큰 장애물 중 하나는 암 세포와 microenvironment 사이의 상호 작용의 복잡성입니다. 특히, 고체 종양은 암과 같은 안티 - 암 치료시 발생하는 세포 죽음 stromal 세포, 하나의 구성 요소의 섭동, 사이의 균형을 개발했기 때문에, 조직 조직에 드라마틱 한 효과가 발생할 수 있습니다.

여기에 제공된 intravital 이미징 기술은 안티 - 암 약물 치료를하는 동안 라이브, anesthetized 마우스의 종양에서 암 세포 기질 상호 작용의 직접적인 시각화 할 수 있습니다. 우리는 ^(17을 참조하십시오 상대 제한된 침투 깊이가 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용 를 한모금,하지만 우리 수술 및 라벨 기술이 현미경 다른 종류의와 함께 사용할 수 있습니다. 이 실험에서 얻은 영화는 형광 강도의 변화 (예를 들어 세포 죽음의 표시 인구 나 유도의 침투로 인해), 세포 운동성, injectables의 배포 (혈관 누출을 추적 할 수 등), 그리고 공동을 포함 프로세스를 추적하는 데 사용할 수 있습니다 형광 신호 ^{5,12,17,20의} 국산화.

우리는 정기적으로 이미지 6 이상 시간 마우스 및 18 세 이상 시간도 수행 이미징. 이 이러한 긴 시간 동안 지속적으로 마취 하에서 쥐를 유지해야합니다. 적절한 마취를 통해 우리 동물의 90 % 이상이 6 시간 생존, 약 80 %가 18시간 이상 생존. 장기 마취를 수행하는 방법에 대한 자세한 내용은 이전에 ¹⁹ 게시했습니다. 우리의 경험에서 다섯 요소가 중요합니다 : u는, 저체온증 피하고 탈수를 피하고 생리 혈액 산소 포화 수준을 유지isoflurane에 대한 humidified 캐리어 가스를 노래하며, 고통의 흔적을 표시하지 않습니다되는 마취의 가장 낮은 수준에서 동물을 유지. 체온을 유지하기 위해, 우리는 (38 ° C에서) 온수 담요 쥐를 유지. 탈수를 방지하기 위해, 우리는 전체 이미징 절차를 통해 생리 IP의 작은 볼륨을 주입. 생리 혈액 산소 포화 수준을 유지하기 위해, 우리는 캐리어 가스 (대신 일반적으로 사용되는 100 %보다)의 21 % 산소로 시작합니다. 시간을 실험에 - - 우리가 마우스하면 흡입 산소 수준을 향상 할 수 있도록 혈액 산소 포화도의 감소를 보여줍니다. 우리의 경험에서, 시간 (30~40%에 등)에서 흡입 산소 수준을 증가시키는 것은 거의 항상 추가 영상의 시간 동안 수 있도록 동물을 안정화합니다. 마취의 최적 수준은 60-65/min와 400-450/min의 펄스 속도의 호흡 속도의 1-1.5 % isoflurane과 결과를 달성 대부분의 마우스입니다. 우리의 이미징 실험에서, 우리는 주로 유전자 변형 마우스 모델을 사용s은 (는) (MMTV-PyMT와 C3 [1] - 태그)하는 종양은 단일 이미지 세션에서 여러 X, Y 위치에서 병렬 종양 진행의 다양한 단계에 여러 개의 병변의 이미징을 허용, multifocal 있습니다. 이 단계에 따라 달라 치료 반응을 확인하기위한 실험에 대해 마우스에 마우스 변화에 대한 우려를 감소, 및 이미징에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다.

intravital 이미징 동안 수행 할 수 있습니다 종양 병변의 병리학 준비가 덜 상세 다른이며, 비록 MMTV-PyMT 모델 (및 기타 자연 암 모델)의 그것보다, intravital 영상 중에 인식 할 수 진보적 인 histopathological 단계를 거칩니다 조직 학적 섹션 ^5,17. 암 세포는 일반적으로 말기 악성 종양에서 분리 될 때 대조적으로, 이식 모델은 가장 늦게 무대 종양을 반영하는 경향이 있습니다. 이러한 모델은 따라서 종양 - 기질을 공부에 더 의무 아르다른 단계 사이의 이러한 상호 작용의 차이보다 늦게 무대 종양의 상호 작용을 확인할 수 있습니다.

우리는 어떻게 치료에 의해 유도 세포 사망 한 후 발생할 이미지 핵 구조 변화에의 예를 보여줍니다. 항암제 치료의 부재에서이 라벨 전략 대신 elucidating, 원위치에서 이미지 세포 분열에 사용할 수 있습니다 예를 들어, 세포 증식과 휴지는 microenvironment에 얼마나 영향을받습니다. 앞으로 mitochondrial 구성 요소의 형광 라벨은 apoptotic 세포 사망하는 동안 발생하는 이미지 mitochondrial 변경하는 것이 가능하게 할 수 있습니다.

이 프로토콜에서는, 우리는 또한 다른 microenvironmental 구성 요소는 시각화 및 이미징 될 수있는 방법을 치료 한 후 이미지 암 세포 면역 세포의 상호 작용에 있지만,의 예를 보여 주었다. stromal 구성 요소에 대한 기존의 형질 기자 라인 (예., FSP1-EGFP ¹⁷ αSMA - RFP ²¹ COL1A1-EG 섬유 아세포를위한 사람들을 포함FP ²¹⁾ 또는 vasculature의 세포 (예 : Tie2-GFP ^22, VEGF-GFP ^23).

Intravital 이미징은 생체 다음과 같은 화학 요법 관리에서 발생하는 상호 작용과 프로세스의 실시간 시각화 할 수 있습니다. 기술이 현재로, 우리는 치료 반응에 영향을 미치는 방법에 골수 양 세포 이해의 주요 진전을 만들었습니다, 종양 microenvironment은 너무나 복잡하기 때문에 그러나, 주요 발전은 여전히​​ 환경 매개 약물 저항을 근간 프로세스에 mechanistically 탐구하기 시작 필요합니다. 여전히 필요한 가장 중요한 발전 중 하나는 특정 세포 집단을위한 더 나은 마커의 식별합니다. 더 나은 마커의 중요성은 잘 유방 종양의 microenvironment, 섬유 아세포와 면역 세포의 가장 눈에 잘 띄는 stromal 세포 구성 요소의 두 사람과 함께 도시된다. α-부드러운 근육 고를 (αSMA)가 자주 식별하는 데 사용됩니다섬유 아세포하지만, 단백질은 혈관 평활근 세포와 세포 myoepithelial ^(24)에 의해 표시됩니다. αSMA-GFP의 기자 마우스가 존재하지만 따라서, 특정 세포 유형을 결정하는 것은 intravital 이미징 실험이 진행되는 동안 다음이되는 것은 도전이다. 마찬가지로, C-FMS 프로모터에서 표현 등 EGFP와 같은 단일 형광 마커는 종종 ^12,17 면역 세포의 여러 subpopulations를 식별합니다. 하나가 이상적으로 특정 세포 유형을 식별하는 단일 마커를 사용하고자하지만 따라서, 기본 생물의 복잡성이 접근법을 사용하여의 주요 과제를 안겨주고 있습니다.

이 문제에 대한 하나의 일부 솔루션은 또한 같은 형광 기자를 표현하는 세포의 subpopulations을 차별화하는 데 injectable 라벨을 사용하는 것입니다. 예를 들어, 형광 dextrans는 대 식세포에 의해 촬영되고 C-FMS-EGFP와 Fsp1-EGFP 유전자 변형의 기자 마우스에 의해 표시하는 대 식세포 subpopulations 라벨을 사용할 수 있습니다 ^{17. 형광 프로브에 복합 항체는 특정 subpopulations를 (C-FMS-EGFP 기자 17에 의해 분류 골수 양 세포의 Gr1 - 긍정적 인 인구 등) 식별하는 데 사용되었습니다.}

어떻게 왜 종양 동물의 큰 무리를 필요로 다른 시간 지점에서 수확 한 조직에서 파생 된 관리 치료, 또는 조직 학적 시리즈에 응답에 대한 약간의 기계론의 정보를 제공 캘리퍼스 측정,에 의해 생성 된 종양 응답 곡선과는 달리, 우리의 기술은 직접, 객관적 정보를 제공합니다 세포 죽음의 역학에 작은 무리의 암 세포와 stromal 세포의 상호 작용에. 따라서, 여기에보고 된 절차를 사용하는 장점은 실시간으로 그대로 종양의 microenvironment의 맥락에서 약물 반응에 대한 동적 정보를 제공한다는 것입니다. 이러한 정보는 ⁵ 치료 반응을 유도하는 기본 프로세스에 중요한 통찰력을 초래할 수 ^</>를 논의하게 될 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
			시약
MMTV-PyMT 마우스	잭슨 연구소	2374
C3 (1) 태그 마우스	잭슨 연구소	13,591
ACTB - ECFP 마우스	잭슨 연구소	3773
ACTB-H2B-EGFP 마우스	잭슨 연구소	5418
1 개 PBS	- 집에서 제작
2 MD Dextran, Fluorescein-복합	Invitrogen	D-7137	1 개 PBS에 희석 1 MG / ML, DH 2 O (-20 ° C 4 MG / ML, 저장)에 Reconstitute
10 KD Dextran, 알렉사 형석 647-복합	Invitrogen	D-22914	1 개 PBS에 희석 1 MG / ML, DH 2 O (-20 ° C 4 MG / ML, 저장)에 Reconstitute
Doxorubicin 염산염	시그마 - 알드리치	44,583	4 번 DH 2 O와 매장에서 Reconstitute는 ° C, 1 개 PBS에 희석
Isothesia (Isoflurane)	버틀러 동물 건강 공급	029450	250 ML
Propidium의 요오드화물	Invitrogen	P3566	1 MG / ML, 희석 1시 15분 1 개 PBS에
질소
산소
			장비
18G × 1 ½ "일반 베벨 바늘	BD	305196
μManager	베일 연구소, UCSF	www.micro - manager.org	오픈 소스 소프트웨어
알코올 면봉	BD	326895	70% 이소 프로필 알콜 면봉
마취 시스템	분자 이미징 제품, (주)
유리 커버	코닝	2940-245	1 ½, 24x50 mm 번호, 70% 이소프로판올 잎사귀와 소독
Curity의 거즈 스폰지 (무균)	켄달	6939
유리 현미경 슬라이드	코닝	2948-75x25	미리 청소, 미리 청소하지 않을 경우 70 % 이소프로판올 잎사귀와 소독
강화 된 고급 가위	정밀 과학 도구	14090-11	이쌍, 스테인레스 강, 날카로운 날카로운 팁, 스트레이트 팁, 26mm 절단 가장자리, 11cm 길이
가열 담요	Gaymar 산업
핫 비드 살균기	정밀 과학 도구	18000-45	사용하기 전에 약 30 분을 켜십시오;> 200 도구를 소독 ° C 30 초에
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