형광 패턴 검사를위한 효모 커뮤니티 Cryosectioning

요약

우리는 형광 세포의 내부 패턴을 관찰 할 효모 커뮤니티를 동결 cryosectioning을위한 프로토콜을 제시한다. 방법은 메탄올 - 고정에 의존하고 지역 사회 내에서 형광 단백질의 운영을 중지시키지 않고 세포의 공간 분포를 유지하기 위해 월 퍼가기.

초록

미생물은 일반적으로 지역 사회에 살고 있습니다. 지역 사회 내에서 세포의 공간적 조직은 지역 사회 ^(1)의 생존과 기능에 영향을 미칠 것으로되어 있습니다. 공 촛점과 두 광자 현미경 등의 광학 sectioning 기술, 박테리아 및 archaeal 지역 사회 ^2,3의 공간 조직을 관찰하는 데 유용 입증했습니다. 공 촛점 이미징 및 효모 식민지의 물리적 sectioning의 조합이 세포 ^4의 내부 조직을 밝혔다. 그러나, 공 촛점 또는 두 광자 현미경을 사용하여 직접 광학 sectioning는 효모 식민지에 깊은 몇 가지 세포 레이어에 도달 할 만 수있었습니다. 이 제한 때문에 효모 세포 ⁴ 빛의 강력한 분산의 가능성이 높습니다.

여기, 우리는 고정와 Saccharomyces cerevisiae의 지역 사회 내에서 형광 세포의 공간적 분포를 얻기 위해 cryosectioning에 따라 방법을 제시한다. 우리는 정착액 에이전트로 메탄올을 사용하여세포의 공간적 분포를 유지합니다. 고정 사회는 그라 이오 스탯에 10월 화합물, 냉동 및 cryosectioned으로 침투하고 있습니다. 섹션의 형광 이미징은 지역 사회의 형광 세포의 내부 조직을 드러내고있다.

빨간색과 녹색 형광 단백질을 표현 변종으로 구성된 효모 지역 사회의 예로는뿐만 아니라 효모 식민지 ^2,3에서 유전자 발현의 같은 형광 세포의 공간 분포를 표시하는 방법 cryosectioning 방법의 가능성을 보여줍니다. 우리의 초점을 Saccharomyces cerevisiae의 지역 사회에있다하더라도, 같은 방법은 잠재적으로 다른 미생물 커뮤니티를 검사하기 위해 적용 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 효모 커뮤니티 해결

1. 막 필터 (, 그림 2A 예를 들어, Millipore MF 막 필터)에 효모 커뮤니티를 성장. 이 프로토콜은 6mm 지름의 멤브레인 필터에 미만 2x10 ⁸ 셀의 전형적인 지역 사회에 해당합니다.
2. 잘 1cm 지름 (그림 2B)의 하단을 충당하기 위해 워트 먼지 541 필터 종이를 사용합니다. 이 워트 먼지 용지는 나중에 단계에서 지역 사회를 전송하는 캐리어로 사용됩니다. 잘에 1 ML 100 % 메탄올을 추가하고 평형을 할 수있는 온도 -20에서 잘 ° C 둡니다.
3. dewar의 액체 N ₂ 놔. 액체에 적어도 15 초 동안 지역 사회를 찍어 N ₂ 트위터 (그림 2C)를 사용하여 액체 질소에 지역 사회를 멈춰 봐.
4. -20 ° C의 메탄올 (그림 2D)의 우물 냉동 사회를 전송합니다. 메탄올에 잠수 할 때 지역 사회가 수평 유지되어 있는지 확인합니다.20 분 동안 기다리십시오. MF 막 필터는 메탄올에서 분해하기 시작합니다.
5. 잘 메탄올의 증발 (그림 2E)에

결과

붉은 색과 녹색으로 태그 경쟁력 인구에게 ^6를 포함하는 효모 지역 사회의 수직 교차 부분의 형광 이미지는 그림 3에 표시됩니다. 이러한 커뮤니티, 효모 및 공간 등의 공유 자원, 대한 경쟁의 두 prototrophic의 변종으로 구성되어 그들의 수직 교차 섹션에 표시 주상 패턴 ^7로 연결됩니다. 단일 셀 해상도 아래는 크로스 섹션에서 해결 할 수 있습니다. 그림 3은 그림 1의 프로토콜 다음과 같은 (아래)와 (위) 메탄올 - 고정하지 않고 얻은 복제 사회의 크로스 섹션을 비교합니다. 고정하지 않고 효모 커뮤니티를 cryosectioning를 들어, 프로토콜은 단계 1.8부터 시작을합니다. 형광 신호는 수정하지 않고 지역 사회의 섹션에 보존되어 있지만, 지역 사회의 무결성이 손상됩니다. 결과 : (1) 일부 셀 부분의 가장자리 주위에 거리에 떠 있으며, (2) 전체 순연령 (즉, 섹션의 일부 sectioning .......

토론

여기에 제시된 절차는 효모 지역 사회의 내부 구조를 검사 할 수있는 방법을 제공합니다. 메탄올 고정 단계 ⁸ 효모 식민지는 융통성하게하고 식민지의 무결성을 유지하지만, 또한 그 결과를 해석에 고려되어야 수축 ^8됩니다. 우리는 일반적으로 직접 ^구를 해결하지 않고 10월에 포함 된 식민지에 비해 효모 식민지의 높이에서 30 %의 수축을 참조하십시오.

수축을 방지하기 위해 cryosectioning에 대한 대안 접근 방식은 직접 10월에있는 커뮤니티를 포함하고이를 고정하는 것입니다. 형광은 직접 삽입에 따라 방법으로 보존하지만, 단점은 각 섹션 내에서 세포를 함께 구속하지 않는입니다. 그 결과, 거리에 섹션 부동, 그리고 섹션의 가장자리에있는 세포의 일부가 sectioning 과정에서 장애 (그림 4) 고통 가능성이 더 높습니다. 그는에 초점을 맞춘 아니지만다시, 효모 지역 사회의 크로스 섹션.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
100 % 메탄올	JT 베이커	9070-01
조직 - 테크 10월 컴파운드	Andwin 과학	4583
워트 먼지 학년 번호 541 수량 필터 종이	워트 먼지	1541-047
Millipore-MF 막 필터	Millipore	HAWP04700
그라 이오 스탯	Leica	CM 1510 S