의 뇌 혈관의 점착성의 염증성 백혈구 분리하기위한 방법 Plasmodium berghei ANKA에 감염된 쥐들이 설명되어 있습니다. 방법은 유동 세포 계측법에 의해 형광 항체와 후속 분석과 얼룩 후 정량화뿐만 아니라 절연 백혈구의 phenotypic 특성 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 P.의 뇌 혈관의 점착성의 염증 세포의 분리 및 특성에 대한 방법을 설명 berghei ANKA에 감염된 쥐. 실험 뇌성 말라리아의 유도, neurologic 증후군이 기생충 변형 결과를 따르게 마우스 변종의 감염 인간 1,2에서 Plasmodium falciparum로 인한 심각한 말라리아 recapitulates 특정 중요한 측면이. 혈액 단계 말라리아의 중년 여인 형태들이 혈관 내피 세포에 바인딩 할 수 있습니다 감염된 적혈구의 표면에 기생 단백질을 표현한다. 이 과정은 hypoxia와 haemorrhages 3 결과, 혈액의 흐름에 장애물을 유도하며 기생충 격리의 사이트에 염증 백혈구의 모집을 자극.
다른 감염, 즉 neutrotopic 바이러스 4-6 말라리아-parasitized 적혈구 (pRBC)뿐만 아니라 관련 inflamm 모두는 달리atory 백혈구는 혈관 내에서 오히려 뇌 실질에 침투보다 분리 된 상태로 유지됩니다. 따라서 비 염증 순환 세포, 장기의 추출 및 조직 처리하기 전에 감염된 - 쥐의 광범위한 intracardial 재관류로 분리 된 백혈구의 오염을 방지하는 것은 혈액 구획을 제거하는이 절차가 필요합니다. 재관류 후, 머리가 수확되고 작은 조각으로 해부 했어요. 조직 구조는 더욱 그 결과 뇌 homogenate 그때 myelin 및 기타 조직 쓰레기들로부터 뇌를 분리 백혈구의 분리 (BSL)을 할 수있는 Percoll 기울기에 centrifuged되어 Collagenase D 및 DNAse I.있는 효소 처리에 의해 방해된다. 절연 셀이 후 씻어 있으며, 유동 세포 계측법에 의한 후속 분석을 위해 형광 항체와 hemocytometer과 스테인드을 사용하여 계산.
이 절차는 염증성 백혈구의 종합적인 phenotypic 특성을 다시에있는 뇌로 마이그레이션 할 수 있습니다뇌졸중뿐만 아니라 바이러스 또는 기생충 감염 등 다양한 자극에 sponse. 방법은 또한 사전 임상 동물 모델에서 소설 항 염증성 치료의 평가에 유용한 도구를 제공합니다.
프로토콜
1. P.있는 마우스의 감염 berghei - ANKA
- 녹이 cryopreserved P.의 나누어지는 berghei ANKA pRBC.
- 두 손으로 구속 기법을 사용하여 뇌성 말라리아에 저항력이 BALB / C 공여 마우스를 (8-12주짜리) 구속. 1 ML의 인슐린 주사기 (28G 바늘을)를 사용 pRBC의 100-200 μl와 마우스를 주입. 일상적으로, 1-2 기증자 마우스가 주입되어 있습니다.
- 후 감염 4~5일에서 (PI) 케이지에서 기증자 마우스를 제거하고 워크 스테이션이나 일회용 작업 패드에 놓으십시오.
- 부드럽게 꼬리의 끝 부분에 마우스를 구속하고 작은 가위를 사용하여 (약 1mm) 꼬리 끝을 잘라. 또는 25 G 바늘을 사용하여 작은 꼬리 구멍이 수행 될 수 있습니다.
- 불투명 엔드 현미경 슬라이드의 끝 부분 마우스의 꼬리 정맥에서 혈액 한 방울을 넣으십시오.
- 45 ° 각도에 두 번째 슬라이드 (확장기)를 놓고 피 드롭으로 다시. 피가 가장자리를 따라 펼쳐지되면, 확장기 - 슬라이드 이브를 밀어핏자국을 할 수있는 현미경 슬라이드에 걸쳐 nly. 비방은 건조한 공기 할 수 있습니다.
- 10 분에....
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결과
그림의 결과입니다. 이 쇼 비율과 perfused 또는 unperfused 말라리아에 감염된 그리고 나이브 제어 마우스의 뇌에서 발견 한 다른 BSL 인구의 절대 숫자. 프로토콜 텍스트에 표시된대로 절연 BSL는 PE - 반 NK1.1과 APC-반 TCR-β 항체 물들했다. 이전 결과 7-9에 의거하여 αβTCR + T 세포는 perfused 말라리아에 감염된 쥐 (6 일 PI)의 뇌에있는 BSL 수영장의 높은 비율을 구성. 이 인구는 크게 (그림 2A-B) 비 perfused 동물의 뇌에 제대로 이루어지지 못해 것으로 나타났다. 이 동물 (그림 2A-B) 비 perfused 뇌에 T 세포 주파수의 명백한 감소는 상당히 높은 비율을 더블 부정적인 세포의 총 수 (- - NK1.1 αβTCR)과 관련된되었습니다. unperfused 뇌에 두 번 부정적인 세포에서 높은 비율과 숫자가 아니라 NA & IU의 말라리아에 감염된 쥐에서만 발견하지 못했습니다ML, VE 컨.......
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토론
BSL의 절연 및 분석은 특성화 및 실험 마우스 모델에서 조직 부상이나 감염에 대한 응답으로 뇌에 이주하는 염증 세포의 정량화 할 수있는 방법입니다. 장기 추출 및 후속 전지 분리하기 전에 혈액 구획의 제거를위한 intracardial 재관류 단계의 도입은 비 염증성 순환 백혈구와 염증 세포의 오염을 방지하기 위해 유용합니다. 이 염증 세포가 뇌 실질 5 침투하는 등 손쥐 뇌척수염 바이러스 등의 neurotropic 감염에 필수적인 요건이 될하지만, 감염된 적혈구와 염증 백혈구가 남아 혈관 내에서 분리 된 것이 아니라 뇌 조직에 침투하는, 쥐 말라리아에 특히 관련이 없을 수도 . 따라서, 말라리아에 감염된 쥐 intracardial 재관류는 BSL의 분석을 권장해서는 안뿐만 아니라 유용 할 수 있습니다기생충 - 조직 격리 10,11의 평가. 비 염증 순환 백혈구와 마찬가지로, 말라리아 기생충의 미숙 한 형태의 혈관 내피을 준수 할 수 있으며, 재관류 절차에 의해 제거해야합니다. 반면, 점.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
저자는 기술 지원을 위해 양을 리아나 Mackiewicz 감사드립니다. 이 작품은 빅토리아 주 정부 운영 인프라 지원 및 호주 정부 국립 보건 의학 연구위원회 IRIISS 및 프로젝트 기금 1,031,212을 통해 가능하게되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 (선택 사항) |
| 솔루션 및 버퍼 | |||
| Giemsa의 다 쥐르 eosin의 메틸렌 블루 용액 | 머크 Millipore | 1.09204.0500 | 증류수에 희석 1시 10분 |
| RPMI 배지 | 마우스 tonicity | ||
| 마우스 tonicity PBS | 20 밀리미터 인산 나트륨, 0.149 NaCl, pH를 7.3 | ||
| 0.4 % Trypan 파랑 | 시그마 알드리치 | T-8154 | 1시 2분 희석 |
| Collagenase D | 생물 화학 워딩 턴 | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | 시그마 알드리치 | D4263-5VL | 소 췌장에서 |
| Percoll | GE 헬스 케어 | 17-0891-01 | PBS의 30 % 솔루션 |
| Ultrapure 트리스 | Invitrogen | 15505-020 | |
| 염화 암모늄 (NH 4 망할 CIA) | AnalaR | 10,017 | |
| 적혈구 용해 버퍼 | 17 MM 트리스, 14nM NH 4 CIA 같으니, pH를 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 나트륨 소금 | 머크 | 10093.5V | 0.1M, pH를 7.2 |
| 항체 conjugates | |||
| 안티 마우스 CD16/CD32 (FC 블록), 클론 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 50 μl 착색 버퍼 1 μl (0.5mg/50 ML) |
| FITC - 안티 - 마우스 CD4, 클론 H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-안티 - 마우스 NK1.1, 클론 PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5 - 안티 - 마우스 CD8, 클론 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC - 반 마우스 TCR-β, 클론 H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-안티 - 마우스 CXCR3, 클론 220,803 | R & D 시스템 | FAB1685P | |
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| 유동 세포 계측법 관 | BD 매 | 352008 |
참고문헌
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis.<....
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