방법 논문

에서 뇌 - 분리 된 백혈구의 분리 및 분석 Plasmodium berghei ANKA에 감염된 마우스

DOI:

10.3791/50112

⸱

2013년 1월 2일

 ,  , 
1The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research

이 논문에서

요약

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의 뇌 혈관의 점착성의 염증성 백혈구 분리하기위한 방법 Plasmodium berghei ANKA에 감염된 쥐들이 설명되어 있습니다. 방법은 유동 세포 계측법에 의해 형광 항체와 후속 분석과 얼룩 후 정량화뿐만 아니라 절연 백혈구의 phenotypic 특성 수 있습니다.

초록

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우리는 P.의 뇌 혈관의 점착성의 염증 세포의 분리 및 특성에 대한 방법을 설명 berghei ANKA에 감염된 쥐. 실험 뇌성 말라리아의 유도, neurologic 증후군이 기생충 변형 결과를 따르게 마우스 변종의 감염 인간 1,2에서 Plasmodium falciparum로 인한 심각한 말라리아 recapitulates 특정 중요한 측면이. 혈액 단계 말라리아의 중년 여인 형태들이 혈관 내피 세포에 바인딩 할 수 있습니다 감염된 적혈구의 표면에 기생 단백질을 표현한다. 이 과정은 hypoxia와 haemorrhages 3 결과, 혈액의 흐름에 장애물을 유도하며 기생충 격리의 사이트에 염증 백혈구의 모집을 자극.

다른 감염, 즉 neutrotopic 바이러스 4-6 말라리아-parasitized 적혈구 (pRBC)뿐만 아니라 관련 inflamm 모두는 달리atory 백혈구는 혈관 내에서 오히려 뇌 실질에 침투보다 분리 된 상태로 유지됩니다. 따라서 비 염증 순환 세포, 장기의 추출 및 조직 처리하기 전에 감염된 - 쥐의 광범위한 intracardial 재관류로 분리 된 백혈구의 오염을 방지하는 것은 혈액 구획을 제거하는이 절차가 필요합니다. 재관류 후, 머리가 수확되고 작은 조각으로 해부 했어요. 조직 구조는 더욱 그 결과 뇌 homogenate 그때 myelin 및 기타 조직 쓰레기들로부터 뇌를 분리 백혈구의 분리 (BSL)을 할 수있는 Percoll 기울기에 centrifuged되어 Collagenase D 및 DNAse I.있는 효소 처리에 의해 방해된다. 절연 셀이 후 씻어 있으며, 유동 세포 계측법에 의한 후속 분석을 위해 형광 항체와 hemocytometer과 스테인드을 사용하여 계산.

이 절차는 염증성 백혈구의 종합적인 phenotypic 특성을 다시에있는 뇌로 마이그레이션 할 수 있습니다뇌졸중뿐만 아니라 바이러스 또는 기생충 감염 등 다양한 자극에 sponse. 방법은 또한 사전 임상 동물 모델에서 소설 항 염증성 치료의 평가에 유용한 도구를 제공합니다.

프로토콜

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1. P.있는 마우스의 감염 berghei - ANKA

  1. 녹이 cryopreserved P.의 나누어지는 berghei ANKA pRBC.
  2. 두 손으로 구속 기법을 사용하여 뇌성 말라리아에 저항력이 BALB / C 공여 마우스를 (8-12주짜리) 구속. 1 ML의 인슐린 주사기 (28G 바늘을)를 사용 pRBC의 100-200 μl와 마우스를 주입. 일상적으로, 1-2 기증자 마우스가 주입되어 있습니다.
  3. 후 감염 4~5일에서 (PI) 케이지에서 기증자 마우스를 제거하고 워크 스테이션이나 일회용 작업 패드에 놓으십시오.
  4. 부드럽게 꼬리의 끝 부분에 마우스를 구속하고 작은 가위를 사용하여 (약 1mm) 꼬리 끝을 잘라. 또는 25 G 바늘을 사용하여 작은 꼬리 구멍이 수행 될 수 있습니다.
  5. 불투명 엔드 현미경 슬라이드의 끝 부분 마우스의 꼬리 정맥에서 혈액 한 방울을 넣으십시오.
  6. 45 ° 각도에 두 번째 슬라이드 (확장기)를 놓고 피 드롭으로 다시. 피가 가장자리를 따라 펼쳐지되면, 확장기 - 슬라이드 이브를 밀어핏자국을 할 수있는 현미경 슬라이드에 걸쳐 nly. 비방은 건조한 공기 할 수 있습니다.
  7. 10 분에 신선하게 조리 된 Giemsa에서 슬라이드를 착색 한 후 30 초 100 %의 메탄올에 피 묻은 얼룩을 수정합니다.
  8. 1 분에 물을 실행에 핏자국을 씻어, 공기 건조 할 수 있으며 현미경 (100x, 석유 침적)에서 슬라이드를 검사합니다. 1000 적혈구 내에서 pRBC을 열거하고 %의 parasitemia를 계산합니다. 그들이 실험 동물의 감염 출혈이되기 전에 기증자 마우스는 2.5-5 % 사이 parasitemia 수준에 도달해야합니다.
  9. heparinized 마이크로 혈소판 모세관을 사용하여 복고풍 궤도 출혈에 의해 기증 마우스에서 혈액을 수집합니다. 모든 실험은 월터 엘리자 홀 연구소 및 동물 윤리위원회의 요구 사항을 준수 수행됩니다. 지역 동물 윤리위원회의 요구에 따라 다른 출혈이 절차를 사용할 수 있습니다. 1X10 6 pRBC/0.2 ML의 최종 농도에 RPMI 매체에서 혈액 필요한 양을 분해. 그을 고려일반 마우스 혈소판 ~ 6x10 9 적혈구 / 1 ML입니다.
  10. intraperitoneally (IP) 1x10 6 pRBC/0.2 ML을 주입하여 실험 C57BL / 6 마우스 (8-12주 이전)를 감염.
  11. 감염된 쥐 parasitemia 수준을 모니터링하려면 단계 1.3-1.8를 따르십시오. Parasitemia는 하루에 2 ~ 3 파이부터 2-3일 모든 결정해야
  12. 쥐가 hunched 모양과 같은 매니페스트 수도 C57BL에서 / 6 심한 말라리아의 증상은, 모피 및 낮은 활동을 주름 옷깃이 달린. 일부 마우스는이 단계에서 복구 할 수 있지만, 자기 righting 반사 손실에 진행은 돌이킬 수없는 질병을 나타냅니다과 동물은 euthanized해야합니다.

2. 마우스 및 뇌 추출의 Intracardial 재관류

  1. 60cm 열 스탠드 상단에 부착 된 열 홀더에 500 ML 저장소를 확보하여 수동 중력 재관류 시스템을 조립. 저수지의 바닥 끝 부분에 플라스틱 튜브를 연결하고 버퍼 흐름을 제어 할 수있는 튜브 클램프를 고정하십시오. 23 G 바늘에 튜브를 연결합니다. FilPBS (22 ° C에 보관)과 저수지까지 내 말은, 클램프 및 모든 기포를 제거하는 튜브를 통해 실행하는 버퍼를 허용 엽니 다.
  2. 안락사시켜야 P. CO 2 흡입하여 berghei ANKA에 감염된 마우스. 페달, 궤도 및 호흡기 반응의 부재에 의해 죽음을 확인합니다.
  3. dorsally 플라스틱 트레이에 포함 된 스티로폼 분해 보드에 뒷다리와 앞 손으로 euthanized 마우스를 핀. 지역 동물 윤리위원회 요구 사항 마취에 따라 intracardial pefusion의 사전 개시를 관리 할 수​​있다.
  4. 70 %의 에탄올과 복부 측면을 닦아주십시오.
  5. 흉강을 노출하는 중간 선을 따라 피부를 열고 대형 가위와 집게를 사용하십시오. 측면에 접어 핀 피부.
  6. 고급 집게로 가슴을 잡고 가로막을 절감하고 가슴의 양쪽을 따라 갈비뼈를 severing. 대용량의 혈관을 손상 않도록주의보십시오.
  7. 머리를 느슨하게 옆에있는 흉골에 의해 흉곽을 고정.
  8. 심실의 지혜를 개최H 고급의 포셉, 고급 가위로 조심스럽게 절개 우심방.
  9. PBS가 실행되는 동안 오름차순 대동맥으로 왼쪽 심실에 비중 재관류 시스템에 부착 23G 바늘을 삽입합니다. 바늘 끝의 0.5 cm를 삽입합니다.
  10. 5 분 또는 유출 될 때까지 마우스를 Perfuse 것은 분명하다.
  11. 고정 해제 마우스와 복부에 놓여 있었다. 70 %의 에탄올과 머리를 닦아주십시오.
  12. 큰 가위를 사용하여, 그냥 자궁 경부 척추 영역 위에 몫을합니다.
  13. 중간 꼬리 - 뱃 부리 장식이있는 컷이 두개골을 노출 떨어져 두개골의 기지에서 시작, 피부 껍질을 벗기면하기 위해 고급 가위를 사용합니다.
  14. 머리 개최, 각 궤도 구멍에 작은 가위 블레이드를 배치하고 궤도 사이의 몫을합니다.
  15. 시상 봉합을 따라 길이 방향 절단을 확인하고 조심스럽게 바깥쪽으로 각각의 뇌 반구에있는 두개골 껍질을 벗기면.
  16. 주걱 사용하여 부드럽게 뇌를 들고 RPMI 매체를 포함하는 10 ML의 원심 분리기 튜브에 넣습니다.

3. 뇌 - 분리 된 백혈구의 절연 (BSL)

  1. 안전 캐비닛에서 근무 곳 갓 RPMI 조직 문화 매체 3-5 ML을 포함하는 배양 접시에있는 스테인리스 스틸 셀 스트레이너 (40-60 메쉬 크기)의 상​​단에 뇌를 수확.
  2. 작은 조각으로 뇌 조직을 잘라 버릴거야.
  3. 크리스탈 플런저를 사용하여 셀 스트레이너를 통해 뇌 조직의 작은 조각을 밀어 넣습니다.
  4. 4에 10 분 ° C.에 250 XG에서 10 ML 튜브와 원심 분리기에 뇌 homogenate를 전송
  5. 0.05 % Collagenase D 및 2U/ml DNAse I.를 포함 RPMI 매체의 3 ML에서 펠렛을 분해
  6. 실온에서 30 분을위한 혼합물을 회전합니다. 70 μm 나일론 셀 스트레이너 및 /를 통해 혼합물을 눌러 5 분 동안 얼음에 잠복기에 의한 세포 파편을 제거합니다.
  7. 실온에서 20 분 400 XG (브레이크)에서 7 ML 30 % Percoll 쿠션과 원심 분리기에 뇌 homogenate를 놓는다.
  8. 5 분에 대한 얼음에 붉은 혈액 세포 용해 버퍼와 품다 1 ML에 Resuspend 펠릿intracardial 재관류에 의해 뇌에서 제거 할 수 없습니다 자기편 pRBC을 lyse.
  9. RPMI 매체 9 ML을 추가, 4 ° C.에 10 분을 위해 250 XG에서 세포와 원심 분리기를 씻어
  10. RPMI 매체와 Eppendorf 튜브에 전송 세포의 50-100 μl에 Resuspend BSL 함유 펠렛.
  11. 가능한 세포의 식별 Trypan 파란색으로 셀 샘플의 5-10 μl 나누어지는 1시 2분을 희석.
  12. hemocytometer를 사용하여 현미경으로 가능한 셀을 계산합니다. 6 일 파이 (Π) 이후, P.에서 berghei ANKA에 감염된 마우스는 20,000-100,000 BSLs을 복구 할 수 있습니다, 신경 증상을 표시합니다.

4. 여러 가지 빛깔의의 유동 세포 계측법에 의해 BSL의 Immunophenotyping

  1. 4에 10 분 ° C에 250 XG에서 세포를 원심 분리기 (PBS, 1 % 태아 송아지 혈청 (FCS), 2mm EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 착색 버퍼 50 μl의 표면에 뜨는 및 resuspend 펠렛을 대기음.
  2. anti-CD16/32 항체 (Fcblock)를 정화의 1 μl를 추가합니다.
  3. 1 세포를 배양얼음에 0 분.
  4. 얼룩 버퍼 1 ML과 세포를 씻으십시오. 4 ° C에서 10 분 동안 250 XG에서 세포를 원심 분리기와 표면에 뜨는을 대기음.
  5. 필요한 형광 항체의 미리 정해진 최적의 dilutions 즉, 안티 - CD4, 항 CD8, 안티 TCR 및 안티 NK1.1를 포함하는 버퍼를 착색의 50 μl에 Resuspend 세포.
  6. 얼음에 1 시간에 품다.
  7. 얼룩 버퍼 1 ML과 세포를 씻으십시오. 4 ° C에서 10 분 동안 250 XG에서 세포를 원심 분리기와 표면에 뜨는을 대기음.
  8. PBS 100 μl에 세포를 Resuspend.
  9. 유동 세포 계측법 플라스틱 튜브에 세포를 전송합니다.
  10. 흐름 cytometer를 사용, 적어도 5,000-10,000 이벤트를 취득. 필요에 따라 적절한 흠없는 셀 컨트롤과 fluorochrome 보상 샘플이 포함되어야합니다.
  11. 적절한 유동 세포 계측법 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석합니다.

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결과

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그림의 결과입니다. 이 쇼 비율과 perfused 또는 unperfused 말라리아에 감염된 그리고 나이브 제어 마우스의 뇌에서 발견 한 다른 BSL 인구의 절대 숫자. 프로토콜 텍스트에 표시된대로 절연 BSL는 PE - 반 NK1.1과 APC-반 TCR-β 항체 물들했다. 이전 결과 7-9에 의거하여 αβTCR + T 세포는 perfused 말라리아에 감염된 쥐 (6 일 PI)의 뇌에있는 BSL 수영장의 높은 비율을 구성. 이 인구는 크게 (그림 2A-B) 비 perfused 동물의 뇌에 제대로 이루어지지 못해 것으로 나타났다. 이 동물 (그림 2A-B) 비 perfused 뇌에 T 세포 주파수의 명백한 감소는 상당히 높은 비율을 더블 부정적인 세포의 총 수 (- - NK1.1 αβTCR)과 관련된되었습니다. unperfused 뇌에 두 번 부정적인 세포에서 높은 비율과 숫자가 아니라 NA & IU의 말라리아에 감염된 쥐에서만 발견하지 못했습니다ML, VE 컨...

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토론

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BSL의 절연 및 분석은 특성화 및 실험 마우스 모델에서 조직 부상이나 감염에 대한 응답으로 뇌에 이주하는 염증 세포의 정량화 할 수있는 방법입니다. 장기 추출 및 후속 전지 분리하기 전에 혈액 구획의 제거를위한 intracardial 재관류 단계의 도입은 비 염증성 순환 백혈구와 염증 세포의 오염을 방지하기 위해 유용합니다. 이 염증 세포가 뇌 실질 5 침투하는 등 손쥐 뇌척수염 바이러스 등의 neurotropic 감염에 필수적인 요건이 될하지만, 감염된 적혈구와 염증 백혈구가 남아 혈관 내에서 분리 된 것이 아니라 뇌 조직에 침투하는, 쥐 말라리아에 특히 관련이 없을 수도 . 따라서, 말라리아에 감염된 쥐 intracardial 재관류는 BSL의 분석을 권장해서는 안뿐만 아니라 유용 할 수 있습니다기생충 - 조직 격리 10,11의 평가. 비 염증 순환 백혈구와 마찬가지로, 말라리아 기생충의 미숙 한 형태의 혈관 내피을 준수 할 수 있으며, 재관류 절차에 의해 제거해야합니다. 반면, 점...

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공개 사항

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

감사의 글

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저자는 기술 지원을 위해 양을 리아나 Mackiewicz 감사드립니다. 이 작품은 빅토리아 주 정부 운영 인프라 지원 및 호주 정부 국립 보건 의학 연구위원회 IRIISS 및 프로젝트 기금 1,031,212을 통해 가능하게되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트 (선택 사항)
솔루션 및 버퍼
Giemsa의 다 쥐르 eosin의 메틸렌 블루 용액 머크 Millipore 1.09204.0500 증류수에 희석 1시 10분
RPMI 배지 마우스 tonicity
마우스 tonicity PBS 20 밀리미터 인산 나트륨, 0.149 NaCl, pH를 7.3
0.4 % Trypan 파랑 시그마 알드리치 T-8154 1시 2분 희석
Collagenase D 생물 화학 워딩 턴
Deoxyribonuclease (DNAse) I 시그마 알드리치 D4263-5VL 소 췌장에서
Percoll GE 헬스 케어 17-0891-01 PBS의 30 % 솔루션
Ultrapure 트리스 Invitrogen 15505-020
염화 암모늄 (NH 4 망할 CIA) AnalaR 10,017
적혈구 용해 버퍼 17 MM 트리스, 14nM NH 4 CIA 같으니, pH를 7.2
FCS Gibco 1009
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 나트륨 소금 머크 10093.5V 0.1M, pH를 7.2
항체 conjugates
안티 마우스 CD16/CD32 (FC 블록), 클론 2.4G2 BD Pharmingen 553142 50 μl 착색 버퍼 1 μl (0.5mg/50 ML)
FITC - 안티 - 마우스 CD4, 클론 H129.19 BD Pharmingen 553651
PE-안티 - 마우스 NK1.1, 클론 PK136 BD Pharmingen 553165
PerCPCy5.5 - 안티 - 마우스 CD8, 클론 53-6-7 BD Pharmingen 551162
APC - 반 마우스 TCR-β, 클론 H57-597 BD Pharmingen 553174
PE-안티 - 마우스 CXCR3, 클론 220,803 R & D 시스템 FAB1685P
Biotinylated - 안티 - 마우스 CCR5, 클론 C34-3448 BD Pharmingen 559922
Steptavidin - PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 551419
장비 및 재료
SuperFrost 현미경 슬라이드 Lomb Menzel - Gläser
분해 집게, 가위 레다 Instrumente
500 ML PBS 저수지 Nalgene
고무 튜빙
23G 바늘 BD PrecisionGlide 302008
세포 분리 키트는 금속 체를 포함하는 시그마 알드리치 CD-1
70 μm 나일론 셀 스트레이너 BD 팔콘 352350
Hemocytometer GmbH의 Neubauer 717810
유동 세포 계측법 관 BD 매 352008

참고문헌

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  1. Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
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